Biorazgradnja atrazina s tremi transgenskimi travami in lucerno, ki izražajo gen za modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo

UVOD

Atrazin je v Združenih državah Amerike eden izmed najbolj uporabljanih herbicidov za zatiranje širokolistnih plevelov pri pridelavi koruze, sirka in sladkornega trsa. Spada med s-triazinske herbicide in inhibira prenos elektronov med fotosintezo. Zaradi obsežne uporabe ter prehajanja v zemljo in vodo prihaja do onesnaženja površinske in podtalne vode na širših območjih. Detekcija atrazina v zemlji in pitni vodi je vzbudila zanimanje za razvoj metod, ki bi preprečile onesnaženje okolja ali omogočile remediacijo. V tej študiji so zato poskušali pripraviti transgenske rastline, ki bi izražale modificirano bakterijsko atrazin klorohidrolazo in tako omogočile bioremediacijo.

PRIPRAVA KONSTRUKTOV IN TESTIRANJA

Za transformacijo so pripravili vektorje pSAM1b, pUAM1b, pSAM1a, pUAM1a ter pPW1 Plus, da so vsebovali modificiran bakterijski gen atzA, ki v Pseudomonas sp. sevu ADP kodira za atrazin klorohidrolazo. Celice kalusa trstikaste bilnice (Festuca arundinacea) so transformirali z pSAM1b ali pUAM1b z biolistično metodo. Kaluse trstikaste bilnice, trpežne ljuljke (Lolium perenne) in okrasnega prosa (Panicum virgatum) so transformirali z uporabo Agrobacterium tumefaciens seva AGL1, ki je vsebovala pSAM1a ali pUAM1a. Lucerno (Medicago sativa L.) so transformirali z agrobakterijo seva LBA4404, ki je vsebovala pPW1Plus. Po začetni selekciji na gojiščih za tkivne kulture in regeneraciji rastlin, so jih ocenili za prisotnost p-atzA gena in izražanje in planta z uporabo PCR in (RT)-PCR. Ker jih je zanimalo, kako odporne so na atrazin, so regenerirane rastline prenesli in 3-4 tedne inkubirali na agarskih gojiščih, ki so jim dodali 2 ali 10 µg/ml atrazina. Po inkubaciji so z vizualnim pregledom ocenili odpornost na atrazin, izgled ter rast rastlin, za nadaljnje analize na hidroponskih gojiščih z dodanim atrazinom pa so uporabili divje tipe (WT) ter samo tiste transgenske linije trstikaste bilnice, okrasnega prosa in lucerne, ki so uspevale na največji koncentraciji atrazina. Primerjali so spremembe povprečne sveže teže in povprečno porabo vode treh vzorčnih rastlin, da so določili razlike med WT in transgenskimi rastlinami pod enakimi pogoji. Aktivnost hidrolitične deklorinacije in vitro so preverili z inkubacijo surovih ekstraktov listov, kron ali korenin z 14C-označenim atrazinom in tenkoplastno kromatografijo, in vivo pa so aktivnost pri trstikasti bilnici in lucerni ocenili s tekočinskim scintilacijskim števcem za določitev masne bilance na osnovi radioaktivnosti rastlinskega rastnega medija in ekstraktov rastlinskih tkiv treh vzorčnih rastlin. Neznane metabolite so določili ob pomoči tekočinske kromatografije visoke ločljivosti sklopljene z masno spektrometrijo.

REZULTATI

Analiza s PCR je pokazala, da je večina transgenskih rastlin vsebovala p-atzA, z (RT)-PCR pa so dokazali, da so transformirane rastline izražale p-atzA mRNA in planta. Hidroponski poskusi so pokazali, da številne od teh transgenskih trav rastejo bolje kot WT rastline v prisotnosti atrazina in so ga sposobne razgraditi v hidroksiatrazin. Trstikasta bilnica, trpežna ljuljka in lucerna pa so hidroksiatrazin razgradile še naprej do drugih metabolitov in planta. Z in vitro in in vivo analizami s tenkoplastno kromatografijo so ugotovili, da so transgenske linije sintetizirale aktivno modificirano atrazin klorohidrolazo, ki je katalizirala deklorinacijo atrazina do hidroksiatrazina v listih, steblih in koreninah transgenske lucerne ter listih, kronah in koreninah trstikaste bilnice. Pokazale so tudi, da je bila večina privzetega atrazina v rastlini razgrajenega. Hidroksiatrazin so našli tudi v hranilni raztopini transgenske lucerne in trstikaste bilnice, poleg tega pa so rastline hidroksiatrazin presnovile še v enega ali dva neznana produkta, česar niso opazili pri WT. To pomeni, da WT rastline ne morejo presnavljati atrazina v hidroksiatrazin in ga zato ne morejo izločati v hranilno raztopino. Neznani produkt so pri trstikasti bilnici identificirali kot 2-hidroksi-4-(etilamino)-6-amino-s-triazin (OEAT).

ZAKLJUČEK

Hidroksiatrazin ni niti herbiciden niti fitotoksičen in kaže večjo nagnjenost k prehajanju v zemljo kot atrazin, poleg tega pa manj substituirane s-triazine mikroorganizmi v zemlji lažje razgradijo. Glede na to, da rastline lahko stimulirajo metabolizem organskih polutantov pri mikroorganizmih, ti rezultati kažejo, da transgenske rastline ne le privzemajo in deklorinirajo atrazina, ampak bi lahko tudi pomagale povečati razgradnjo atrazina z mikroorganizmi. Sposobnost posamezne konstruirane transgenske linije za biorazgradnjo atrazina v zemlji in nadaljno razgradnjo atrazina nameravajo še preučiti v bližnji prihodnosti. Z izbiro transgenskih rastlin z najvišjo učinkovitostjo biorazgradnje pa jih bodo lahko v prihodnosti uporabili v rastlinskih varovalnih pasovih za filtriranje, razgradnjo in odstranjevanje atrazina iz okolja.

VIRI

A. W. Vail et al. Biodegradation of atrazine by three transgenic grasses and alfalfa expressing a modified bacterial atrazine chlorohydrolase gene. Transgenic Research, 29. 11. 2014