Integracija genov za sintezo hialuronske kisline v kromosom bakterije Lactococcus lactis izboljša sintezo visokomolekularne hialuronske kisline

UVOD

Hialuronska kislina (HA) ali hialuronan je linearen biološki polimer. Ni imunogen ali toksičen, je biokompatibilen in ima sposobnost zadrževanja vlage, zato je privlačen za uporabo v medicinske in kozmetične namene. Uporabnost HA je odvisna od njene molekulske mase; najbolj uporabna je HA z molekulsko maso 4-10 MDa. HA je sestavljena iz disaharidnih enot D-glukuronske kisline (GlcUA) in N-acetilgukozamina (GlcNAc), ki sta povezana z β-1,3-vezjo, enote pa se v polimer povezujejo z β-1,4-vezjo. Geni hasA, hasB in hasC predstavljajo strukturne gene has operona, ki zapisuje za proteine v sintezni poti HA. Tradicionalen način pridobivanja HA je izolacija iz petelinjih grebenov, vendar metodo otežujejo visoka vsebnost proteoglikanov, morebitna prisotnost virusov in vprašanje etike, zato je tradicionalno pridobivanje HA nadomestilo biotehnološko pridobivanje z različnimi bakterijskimi vrstami. Potencialno uporabna bakterija je tudi L. lactis, ki ima splošno priznan varen status in jo najpogosteje uporabljajo v mlečni industriji.

NAMEN RAZISKAVE

Izražanje genov za sintezo HA na plazmidu je prehodno, zato so raziskovalci želeli pripraviti genski konstrukt, ki omogoča integracijo genov has (iz S. zooepidemicus) v kromosom bakterije L. lactis. Namen tega je povečati stabilnost izražanja genov za sintezo HA in opazovati vlogo različnih faktorjev (kot je npr. koncentracija prekurzorjev) na molekulsko maso HA. Na koncu so želeli izvesti primerjalno študijo med vsebnostjo visokomolekularne HA v sevu z zapisom za sintezo HA na plazmidu in sevom, ki ima zapis vstavljen v kromosom.

METODE

Da bi genski zapis za sintezo HA vstavili v kromosom, so pripravili integracijsko kaseto s konci, komplementarnimi tistim na kromosomu, ki omogočajo homologno rekombinacijo. Le-ta poteka na 2000 bp mestu znotraj regije nisRK na kromosomu bakterije L. lactis NZ9000. Pripravili so dva rekombinantna seva; VRJ2AB (zapis hasA-hasB) in VRJ3ABC (zapis hasA-hasB-hasC). V sevih, kjer je potekla homologna rekombinacija preko ene verige, so dokazovali odpornost proti eritromicinu, saj je bila odpornost zapisana na plazmidu. V sevih, kjer je potekla homologna rekombinacija preko dveh verig, pa so dokazovali odpornost proti 5-fluoroorotatom.

REZULTATI IN ZAKLJUČEK

Na petrijevkah z gojiščem M17 z dodano glukozo so zrasle celice, ki so izločale mukozno plast HA in so se v primerjavi s kontrolnimi celicami L. lactis NZ9000 zlepljale v skupke. Nato so dokazali, da se je integracijska kaseta vstavila v kromosom L. lactis NZ9000. Izbrali so samo kolonije, ki so zrasle ob prisotnosti 5-fluoroorotata in z metodo PCR pomnožili zapis za vstavljen genski konstrukt. Rezultati so pokazali, da se je genski konstrukt s homologno rekombinacijo integriral v kromosom L. lactis. Enako so pokazali testi PCR produktov po 30ih generacijah, ki so še vedno vsebovali zapis hasA-hasB ali hasA-hasB-hasC. Bolj visokomolekularno HA so proizvajale celice seva VRJ3ABC (hasA-hasB-hasC), zato ker se je povečala sinteza UDP-GlcUA, ki poveča sintezo HA. S primerjalnimi študijami so dokazali, da so sevi, ki imajo zapis za sintezo HA integriran v kromosom, proizvajali HA višje molekulske mase v primerjavi s sevi, ki so imeli zapis za sintezo HA na plazmidu. S študijami mRNA so tudi pokazali, da je molekulska masa HA odvisna od ekspresije gena hasB; večja kot je ekspresija, večjo molekulsko maso ima HA.

VIRI

1. Hmar RV, Prasad SB, Jayaraman G, Ramachandran KB. Chromosomal integration of hyaluronic acid synthesis (has) genes enhances the molecular weight of hyaluronan produced in Lactococcus lactis. Biotechnol J. 2014:1554-1564. doi:10.1002/biot.201400215.

2. Liu L, Liu Y, Li J, Du G, Chen J. Microbial production of hyaluronic acid: current state, challenges, and perspectives. Microb Cell Fact. 2011;10(1):99. doi:10.1186/1475-2859-10-99.

3. Linares DM, Kok J, Poolman B. Genome sequences of Lactococcus lactis MG1363 (revised) and NZ9000 and comparative physiological studies. J Bacteriol. 2010;192(21):5806-5812. doi:10.1128/JB.00533-10.