Vizualizacija evolucije v realnem času – metoda za sevno inženirstvo

Uvod

Večina industrijsko pomembnih fenotipov, prisotnih pri mikrobih, je posledica medsebojnega delovanja več lokusov. To pomeni, da bi bilo potrebno za racionalni inženiring sevov mikrobov poznati medsebojno delovanje vseh lokusov. Tega znanja še nimamo. Klasično so to težavo reševali s serijo več zaporednih naključnih mutacij in selekcijo sevov z želenim fenotipom. Žal se poleg ugodnih mutacij na ta način v genom vnesejo tudi številne mutacije z škodljivim učinkom in negativnimi epistatičnimi učinki. Temu se izognemo, če združimo želeni fenotip z rastjo med procesom in vitro adaptivne evolucije. Poskus je izveden tako, da mikroorganizme izpostavimo selekciji za izbrani fenotip. Preko naravne selekcije ali mutageneze bo po več generacijah začel prevladovati sev, ki bo izražal želeno prilagoditev. Seve izoliramo in preučimo ozadje, ki omogoča preživetje mikroorganizma. Ozadje lahko preučujemo na različnih nivojih in pri tem uporabimo kombinacije, kot so resekveniranje celotnih genomov <ref name="ref1">Comas,I.,Borrell,S.,Roetzer,A.,Rose,G., Malla,B.,Kato-Maeda,M.,Galagan, J.,Niemann,S.,andGagneux,S. (2012).Whole-genomesequencing ofrifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis strains identifies compensatory mutations in RNA polymerasegenes. Nat.Genet. 44, 106–110.</ref> <ref name="ref2">Toprak,E.,Veres,A.,Michel,J.-B.,Chait, R.,Hartl,D.L.,andKishony,R. (2012). Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nat.Genet. 44, 101–105.</ref>, orodja transkriptmike <ref name="ref3">Fitzgerald,J.R.,andMusser,J.M.(2001). Evolutionary genomics of pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 9, 547–553.</ref> <ref name="ref4">Paulsen,I.T.,Chen,J.,Nelson,K.E.,and Saier,M.H.(2001).Comparative genomics of microbial drug efflux systems. J.Mol.Microbiol.Biotechnol. 3, 145–150.</ref>, proteomike <ref name="ref5">Callister,S.J.,McCue,L.A.,Turse,J.E., Monroe,M.E.,Auberry,K.J.,Smith,R. D.,Adkins,J.N.,andLipton,M.S. (2008).Comparative bacterial proteomics:analysis of the core genome concept. PLoSONE 3, e1542.doi:10.1371/journal.pone.0001542</ref> <ref name="ref6">Boulais, J.,Trost,M.,Landry,C.R.,Dieckmann, R.,Levy,E.D.,Soldati,T.,Michnick,S.W.,Thibault,P., and Desjardins,M.(2010).Molecular characterization of the evolution of phagosomes. Mol.Syst.Biol.6, 423.</ref>in metabolomike <ref name="ref7">Ding,M.Z.,Zhou,X.,andYuan,Y.J.(2010).Metabolome profiling reveals adaptive evolution of Saccharomyces cerevisiae during repeated vacuum fermentations. Metabolomics 6,42–55.</ref> <ref name="ref8">Goodarzi, H.,Bennett,B.D.,Amini,S., Reaves,M.L.,Hottes,A.K.,Rabinowitz,J.D.,andTavazoie,S.(2010). Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Mol.Syst.Biol. 6, 378.</ref>. Pridobljene informacije nam lahko služijo za nadaljnjo racionalno inženirstvo sevov mikroorganizmov. Adaptivna evolucija je bila uporabljena za pridobitev sevov, ki so kazali povečano toleranco na inhibitorje <ref name="ref9">Minty,J.,Lesnefsky,A.,Lin,F.,Chen,Y.,Zaroff,T.,Veloso,A.,Xie,B.,McConnell,C.,Ward,R.,Schwartz,D.,Rouillard,J.-M.,Gao,Y.,Gulari, E., andLin,X.(2011).Evolution combined with genomic study elucidates genetic bases of isobutanol tolerance in Escherichia coli. Microb. CellFact. 10, 18.</ref>, pa tudi za seve s povečano proizvodnjo produktov <ref name="ref10">Hu,H.,and Wood,T.K.(2010).An evolved Escherichia coli strain for producing hydrogen and ethanol from glycerol. Biochem.Biophys.Res.Commun. 391, 1033–1038.</ref>. V adaptivni evoluciji klone tipično izoliramo ob določenih časovnih točkah ali pa na koncu eksperimenta. Populacija mikroorganizmov je med adaptivno evolucijo heterogena, medklonalna kompeticija pa lahko vodi do izgube ugodnih mutant. Vzorce večinoma izoliramo ob intervalih, ki ne sovpadajo z dogodki pojavitve ugodnih mutacij, zato lahko zgrešimo identifikacijo nekaterih prilagoditvenih mutacij, ki so nastale med adaptivno evolucijo.

Adaptivna krajina

Adaptivna krajina je večdimenzionalna površina, ki predstavlja genski doprinos (fitnes) organizma v določenem okolju. Idejo je prvič predstavil Wright v 1931 kot površino selekcijskih vrednosti <ref name="ref11">Wright,S.(1931).Evolution in Mendelian populations. Genetics 16,0097–0159.</ref>. Narišemo jo tako, da vsakemu genotipu pripišemo vrednost genskega doprinosa za specifično okolje. Krajina je lahko ploska z enim samim vrhom - optimumom. V takšnem okolju mora populacija mikroorganizmov pridobiti točno določen set mutacij, da zavzame optimum za dano okolje. Lahko pa je krajina razgibana in so dostopnim optimumi odvisni od začetne točke. Oba tipa adaptivne krajine sta značilna za proces adaptivne in vitro evolucije <ref name="ref12">Orr,H.A.(2005).The genetic theory of adaptation: a brief history. Nat.Rev.Genet. 6, 119–127</ref><ref name="ref13">Weinreich,D.M.,Delaney,N.F.,DePristo,M.A.,and Hartl,D.L. (2006). Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science 312, 111–114.</ref><ref name="ref14">Gresham,D.,Desai,M.M.,Tucker,C.M.,Jenq,H.T.,Pai,D.A.,Ward,A., DeSevo,C.G.,Botstein,D.,and Dunham, M.J.(2008).The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoSGenet.4, e1000303.doi:10.1371/journal.pgen.1000303</ref>. Naravna selekcija tipično vodi populacije do najbližjega lokalnega optimuma, ki ni nujno globalni optimum. V pogojih, ki ne omogočajo spolne reprodukcije mikroorganizmov, populacije ostajajo ujete v lokalnih minimumih (Lenski et al., 1998). Za dosego globalnih optimumov morajo pogoji dovoljevati večje »skoke« po adaptivni krajini. Te »skoke« omogoča rekombinacija in horizontalni genski prenos. Rekombinacija omogoči prenos in združevanje koristnih mutacij s sinergijskimi učinki in odstranjevanje škodljivih mutacij, ki so jih pridobili sevi v procesu adaptivne evolucije. Horizontalni genski prenos pa omogoča pridobitev novih funkcij.