Mikrobna produkcija izoprenoidov s sintezno biologijo

Uvod

Mikrobna biosinteza naravnih produktov ponuja prednosti pred ekstrakcijo biomase in kemične sinteze. Naravni gostitelj naravnih produktov, običajno rastline, rastejo počasi v različnih podnebjih in lahko pride do škodljivih variacij in do koncentracij produkta. Ekstrakcija biomase pogosto zahteva znatno več energije in več materiala za dosego zadostnega izkoristka produkta. Kemijska sinteza stremi k proizvajanju naravnih produktov. Potrebuje tudi veliko večjo količino energije medtem, ko proizvaja še toksične stranske produkte. Mikrobna biosinteza naravnih produktov nam pomaga, da se rešimo teh problemov. Biosintezna pot iz nativnih gostiteljev so presktrukturirali v vodljive platformne organizme, običajno E. coli ali S. Cerevisiae, katere nam služijo kot mikrobno celične tovarne. Mikrobi lahko porabljajo poceni vir ogljika, imajo kratki podvojevalni čas in proizvedejo visoko funkcionalni produkt z dodano vrednostjo in brez stranskih produktov. Mikrobna biosinteza je zelo primerna za produkcijo velikega števila naravnih produktov, vključujoč izoprenoide. Izoprenoidi so pomembni sekundarni metaboliti za zdravstveno industrijo. Sestavljeni so iz petih ogljikovih izoprenskih enot, ki se med seboj razlikujejo po cikliziranju in po preurejanju dodatnih skupin. Izoprenoidi, ki so jih včasih klicali tudi terpenoidi, imajo več kot 40000 unikatnih struktur. Terpenoidi so razvrščeni glede na njihovo število izoprenskih enot. Monoterpeni so iz dveh izoprenskih enot, seskuiterpeni (3 enote), diterpen (4 enote), triterpen (6 enot), karotenoidi ali tetraterpeni (8 enot). Pomembne spojine za zdravstveno industrijo lahko najdemo v veliko terpenoidnih razredih, vključno s karotenoidnim likopenom, seskuiterpena artemisinina, diterpena paklitaksela in triterpena 'domače' lekarne. Orodja sintetične biologije nam pomagajo povečati dostopnost izoprenoidov na trgu. Naravno biosintetično pot lahko enostavno prenesemo v industrijsko primernega gostitelja, kot sta E. coli in S. Cerevisiae. Končni titri željenega produkta bi postali dovolj visoki, da se doseže ekonomičnost. To dosežemo tako, da pot racionalno konstruiramo in optimiziramo. Razumni titri za komercialno produkcijsko skalo so trenutno neznanka. Pregledni članek kaže, da je 0,5 g/L ustrezna začetna točka za visoko vrednost spojine. Prvič je potrebno, da metabolna pot sintetizira želeni produkt. Drugič moramo izbrati primernega gostitelja za industrijsko produkcijo. Tretjič moramo prestrukturirati biosintetsko pot in gostitelja, da lahko operirata skupaj, nakar sledi optimizacija tako, da produkcija lahko postane komercialno relavantna. Te korake uporabljajo številne raziskovalne skupine za ustvarjanje biogoriv, blagovnih kemikalij in produktov zdravstvene industrije. Ta pregledni članek se fokusira na mikrobno proizvodnjo izoprenoidov za zdravstveno industrijo in napredovanje le te skozi sintetično biologijo. Štirje od desetih izoprenoidov o katerih bomo govorili se ali pa še bodo uporabljali v bližnji prihodnosti.

Izoprenoidna pot

Čeprav so izoprenoidi velika skupina različnih spojin, so sintetizirani s podobno metabolno potjo. Izoprenoidna pot se začne s pretvorbo acetil-CoA v izopentenil difosfat (IPP). IPP je nato izomeriziran v dimetilalil difosfat (DMAPP), ki sestavlja geranil difosfat (GPP), nato farnezil difosfat (FPP), nato geranilgeranil difosfat (GGPP). Na zadnjih treh stopnjah različni izoprenoidi razidejo metabolne poti. Dve poti obstajata za produkcijo prekurzerjev komponent IPP in DMAPP, mevalonatna pot in metilritol fosfatna (MEP) pot. Tako imajo raziskovalci več možnosti, ko si izbirajo metabolno pot za proizvodnjo izbranega izoprenoida. Izoprenoidno pot so izrazili v različnih gostiteljih in uporablili so gene iz različnostih virov. Večjo zalogo prekurzorja IPP so poskusili dobiti s kar nekaj tehnologijami, da bi izboljšali komerciano upravičenost izoprenoidnih poti. Martin in sodelavci so začeli z njihovim delom na sintezi seskuiterpena artemisinina z uporabo mevalonatne poti v S.cerevisiae v dveh operonih, ki so jih izrazili v E.coli. Zaradi post transkripcijskih procesov je uravnovešenje izražanja genov težje. Za premostitev problema so naredili seznam »nastavljivih znotrajceličnih regij« (TIGRs) in kombinacije kontrolnih elementov (RBS, sekundarne strukture mRNA in Rnaze cepitvenih mest) so pregledali in izbrali sev E.coli, ki proizvede 7x več mevalonata. Shiba in sodelavci so ojačali pretok prekurzerjev v mevalonatni poti v S.cerevisiae tako, da so prekomerno izrazili acetaldehid dehidrogenaze in uporabili so acetil CoA sintetazo iz salmonella enterica. Te spremembe zagotavljajo večji pretok ogljika v citosolu, in ne v mitohondriju in rezultat je več malovanata. Za povišanje produkcije likopena so povečali zaloge prekurzerjev. Izbrali so sintetično mevalonatno pot v E.coli, ki vključuje mevalonat kinaza iz kvasovke (yMVK), človeški 5-fosfomevalonat kinaza (hPMK), kvasovkina 5-difosfomevalonat dekarboksilaza (yPMD) in IPP/DMAPP izomeraza iz E.coli. Dueber in kolegi so ustvarili sintetično proteinsko ogrodje za ko-lokaliziranje encimov mevalonatne poti, ki vodi v 77x izboljšanje titra. Ta pristop demonstrira, da je visoka proizvodnja mevalonata lahko dosežena z nizko izraženimi encimi in zmanjšanjem metabolnega bremena.

Karotenoidi

Karotenoidi so med prvimi naravnimi produkti, katerih titer so izboljšali z orodji sintetične biologije. Prejšnja raziskovalna dela so se navezovala na povečanje zaloge intermediatov v prvih korakih izoprenoidne poti. V 1997 so produkcijo karatenoida v E.coli izboljšala za faktor 2,7, na skupno 1,3 mg/g suhe celične teže (dcw) in sicer s heterolognim genom za IPP izomerazo. Albrecht in sodelavci so leta 1999 povišali izražanje ß-karotena in zeaksantina za 3,5 krat, in dosegli 1,5 in 1,6 mg/g dcw s prekomerno izraženimi različnimi kombinacijami genov za IPP izomerazo iz Xanthophyllomyces dendrorhous, GGPP sintaze iz Sulfolobus acidocaldarius in nativne DXP sintaze. Wang in sodelavci so dosegli več kot 50 kratno izboljšanje v količini astaksanthina, ki ga uporabljamo za zdravljenje nekaterih degenerativnih nevroloških bolezni. Povišanje količine astaksanthina jim je uspelo s povišano izražanje encimov IPP in GGPP. Neovirana metabolna produkcija pa lahko vodi do metabolnega neravnovesja. Farmer in Liao sta leta 2000 prestrukturirala globalno regulatorni sistem v E.coli, in sicer tako da je likopenska produkcija prisotna le ob zadostni količini glukoze. Ta kontrolna zanka je zmanjšala metabolno neravnovesje kar je povišalo končni donos. Zadnje čase pa so uporabljali novo močno tehniko za izboljšanje karotenoidne produkcije. Jin in Stephanopoulos (2007) sta skostrurirala set sevov E.coli za produkcijsko likopena, ki vključujejo različne kombinacije prekomernih izražanj in izbitih genov. Najboljša kombinacija genov je povečala produkcijo na 16 mg/g dcw. ß-karoten je dosegel 6 mg/g dcw tako, da so zamenjali nativni promotor za kromosomske gene dxs, ispDisF, idi in ispB z močnim promotorjem T5 iz bakteriofaga. Prilagojeni kromosomski geni predstavljajo manjše metabolno breme na pram tehnike povišanega števila kopij vektorja za izražanje tarčnih genov. Lemuth in sodelavci so uporabili podobno tehniko z ravnotežnim izražanjem genov pod promotorji crtE, crtB, crtI, crtY in crtZ iz organizma Pantoea ananatis in vrtW148 iz Nostoc punctiforme, ki so jih vstavili v kromosom E.coli. Ta sev je proizvedel 1,4 mg/g dcw astaksantina kot edinega predstavnika karotenoidov v produktu. Uporaba metode zaporednih genskih sklopov v Bacillus substilis jim je omogočilo vstaviti več genov v enem koraku. Nishizaki in sodelavci so s pomočjo te metode odkrili optimum delovanja genov, ki skupaj producirajo 820 µg zeaxamina/g dcw. S strategijo 'pregleda metabolnih tokov ob prisili toka, ki vodi v produkt' so našli gene, ki znižujejo količino produkta. Nato so te gene izbili in dosegli 12,32 mg likopena/g dcw.

Artemisinin

Mikrobna produkcija potencialnega anti-malarijskega zdravila artemisinin se je mnogo izboljšala z uporabo prednosti sintezne biologije. Z uravnovešanjem metabolnih pretokov in z optimiziranimi kodoni gena za sintazo amorfadiena so Martin in sodelavci povišali titer amorfadiene (prekurzor artemisinina). Ro in sodelavci so prestrukturirali mevalonatno pot v S. cerevisiae tako, da so povišali produkcijo FPP-ja, vstavili gen za amorfadien sintazo iz Artemisia annua in citokrom P450 za končni oksidativni korak. Modifikacija je omogočila donos v višini 100 mg/l artemisinične kisline. Anthony je dosegel titer amorphdiena 293 mg/l z identifikacijo limitnih encimskih reakcij in z uravnovešanjem genske ekspresije skozi število kopij plazmidov in močjo promotorjev. V laboratoriju Keaslinga so nadgradili dosedanje raziskave in z prekomernim izražanjem vsakega encima v mevalonatni poti in z optimizacijo fermentacijskih pogojev so dosegli več kot 40 g/l amorfadiena.

Diterpeni in drugi seskviterpeni

Biosintetska pot za različne diterpene in seskviterpene so prestrukturirali za povečanje proizvodnje skozi sintezno biologijo. Za maksimalno produkcijo nekaterih seskviterpenov so Asadollahi in sodelavci zamenjali nativni ERG9 promotor, ki je odgovoren za preusmerjanje terpenoidnega prekurzorja FPP. Ta promotor tekmuje za prekurzor s promotorjem MET3, ki je odgovoren za metionin. Po optimizaciji ravni metionina so dosegli 16,9 mg/l patkoulola, ki je začetna komponenta v kemijski sintezi kemoterapeutskega zdravila paclitaxel (Taxol). Scalcinati in sodelavci so promotor ERG9 združili s promotorjem HXT1, ki je odziven na glukozo. Gena za lipid fosfat fosfatazo in pirofosfat fosfataza so izbili, dodali pa so gen za encim, ki katalizira reakcijo do α-santalen, ki je kemopreventativ za kožnega raka. Dobili so ga 0,21 mg/g dcw. Kaj se dogaja s produktom med procesom je lahko tudi omejujoč dejavnik. Geranilgeranil difosfat sintazno – levopimaradien sintazno pot so mutirali, tako da so dobili stabilnejši prekurzor. Ta pristop je vodil k 2600 kratnem povišanju, 700 mg/l diterpena levopimaradien, ki se uporablja za produkcijo starega medicinskega zdravila ginkgolide.

Paclitaxel

Uporaba orodij sintezne biologije za mikrobno produkcijo lahko zmanjšajo cene kemoterpevtika paclitaxel in ga tako naredile dostopnejše. Paclitaxel (taxol) je potencialno kemoterapevtsko zdravilo, ki ga je zelo težko sintetizirati in učinkovitost pri ekstrakciji je zelo nizka. Pridobivajo ga iz lubja redke Pacifične tise. Dejong in sodelavci so prvi poskusili mikrobno proizvajati Taxol v S. cerevisiae, ampak je bila koncentracija taxadiena (intermediat Taxola) zelo nizka. Naredili so še nekaj sprememb. Uporabili so alternativno geranilgeranil difosfat sintazo iz S. Acidocaldarius, prav tako so optimizirali kodon taxadien sintaze iz Taxus chinensis. Dobili so 40 kratno povečanje titra (8,7 mg/l). E.coli kot gostitelja so ajikumar in sodelavci spremenili tako, da so razdelili metabolno pot v manjše module in spontano variirali stopnjo izražanja, da bi določili optimalno ravnotežje izražanj. Ta metoda je dala 1 g/l taxadiena. Čeprav izzivi za biosintezo Taxola in ostalih spojin ostajajo, je spekter izboljšav v mikrobni produkciji izoprenov širok in to nam daje upanja za povišanje ostopnosti zdravil z nižjo ceno.

Zaključek

Zadnje desetletje smo bili priča potencialu sintezne biologije, da ustvarimo mikrobno produkcijo izoprenoidnov na industrijski skali. Razvoj dodatnih orodij vodi do nadaljnjih izboljšav na področju. Nepopolno razumevanje kompleksnosti biosintetskih poti nas omejuje k nadaljnjem razvoju mikrobnih produkcij. Nadaljnje inovacije v sistemu biologije nas dajejo tudi možnost, da bomo imeli metabolne mreže, ki napovejo potencialni matematični modeli in tako sposobnost generiranja optimizirane mikrobne celične tovarne. Izboljšave na področju encimskega inžiniringa bo prispeval k strukturiranju biosintetskih poti de novo. Z vključitvijo teh strategij bomo lahko ustvarili mikrobe, ki jih bomo uporabljali za produkcijo medicinsko pomembnih spojin na industrijski ravni.

Viri

• Immethun, M. C., A. G. Hoynes-O'Connor, A. Balassy, and T. S. Moon. 2013. Microbial production of isoprenoids enabled by synthetic biology. Front Microbiol. 2013 Apr 4;4:75. doi: 10.3389/fmicb.2013.00075.

• Tsuge, K., M. Itaya. 2010. Gene cluster or operon design by ordered gene assembly on bacillus substilis (OGAB) method. Bioengineering: Principles, Methodologies and Applications. ISBN: 978-1-60741-762-0. pp. 153-168.

• Farmer, W. R., and J. C. Liao. 2000. Improving lycopene production in Escherichia coli by engineering metabolic control. Nat Biotechnol. 18(5):533-7. • Martin, V. J. J., D. J. Pitera, S. T. Withers, J. D. Newman, and J. D. Keasling. Engineering a mevalonate pathway in Escherichia coli for production of terpenoids. Nat Biotechnol. 2003 Jul;21(7):796-802. Epub 2003 Jun 1. • Pfleger B.F., D. J. Pitera, C. D. Smolke, J. D. Keasling. Combinatorial engineering of intergenic regions in operons tunes expression of multiple genes. Nat Biotechnol. 2006 Aug;24(8):1027-32. Epub 2006 Jul 16.