Inženiring bioloških sistemov v širšem kontekstu

Uvod

Svet se bo v prihodnjih letih in desetletjih prisiljen soočiti s številnimi globalnimi problemi s področij kmetijstva, energetike, ekologije in zdravstva. Pri reševanju teh problemov nam bo lahko v veliko pomoč sintezna biologija saj nam načrtovanje organizmov omogoča, da ti za nas opravljajo želene funkcije. Za dosego tega se poslužuje racionalnega dizajna procesiranja informacij v gostiteljski celici, načrtovanja ekosistemov z uporabo sintezne ekologije ali simulacijo evolucije za izbor želene funkcije. Pri tem smo omejeni z našim pomanjkljivim poznavanjem molekularnih procesov, pomanjkanje kontrole signalnih poti in kako izluščiti splošne principe, ki bi nam omogočili delovanje v spremenljivih okoljih. Za razširitev uporabe sintezne biologije zunaj laboratorijev morejo biti organizmi sposobni preživeti , ohranjati svojo funkcionalnost in se namnožiti v kompleksnih in spremenljivih okoljih. Tovrstna okolja so na primer bioreaktorji, živalski mikrobiom in rastlinska rizosfera. Če želimo, da bodo organizmi sposobni preživetja v realnem okolju bomo mogli pri njihovem načrtovanju upoštevati številne dejavnike. Pri tem so nam v pomoč številni mehanizmi, ki so že naravno prisotni v organizmih in ekosistemih.

Odgovori na okoljske dejavnike

V naravnih okoljih so celice neprestano izpostavljene različnim signalom iz okolja. Mednje spadajo hranila, antimikrobne snovi, signalne molekule in spremenljivi fizikalno kemijski dejavniki kot sta pH in temperatura. Za uspešno preživetje in rast morejo biti celice sposobne natančno zaznati in pravilno odgovoriti na različne signale. Pri tem so celice v nekaterih primerih sposobne svoj odgovor oblikovati na podlagi predhodne zgodovine signalov. Na celični ravni tako obstajajo regulatorni mehanizmi, ki so sposobni zaznati stanje v okolju, procesirati informacijo in se odzvati s spremembo fiziološkega stanja celic. Za odgovor na spremembe v okolju so organizmi razvili različne strategije. Najpogostejša strategija odgovora na signale deluje po principu zaznava-obdelava-odgovor. Tovrstne strategije so vsesplošno prisotne vendar imajo tudi nekatere pomanjkljivosti. Prva pomanjkljivost je energijsko breme, ki ga za celico predstavlja sinteza biomolekul potrebnih za zaznavo signala iz okolja. Druga pomanjkljivost je natančnost sklepanja o najverjetnejšem stanju okolja in natančnost prenosa signalov. Tretja takšna pomanjkljivost je časovni zamik pri odgovoru. To lahko vodi v napačne odločitve, h katerim botrujejo šum v informacijah in hitre spremembe v okolju, kar ima lahko katastrofalne posledice za organizme. Določene tovrstne težave se da odpraviti s fenotipsko diversifikacijo, ki je prav tako uporabljajo celice za odgovor na signale iz okolja. Še tretji način pa je stohastično zaznavanje, ki mu sledi stohastični odgovor. Če se signali iz okolja pojavljajo dovolj pogosto v določenem vzorcu so organizmi sposobni razviti regulatorne mehanizme s predvidevanjem nadaljnjih dogodkov. Tako se organizmi lahko vnaprej pripravijo na dogodke, ki bodo verjetno sledili. Takšne prilagoditve se običajno razvijejo šele na evolucijski časovni skali. Vendar je bilo ugotovljeno, da so nekatere tovrstne prilagoditve možne tudi na krajši laboratorijski časovni skali, kar kaže na evolucijsko plastičnost regulatornih omrežij.

Vloga raznovrstnosti

Raznolikost znotraj populacije igra pomembno vlogo pri odgovoru vrste na nenadne stresne dogodke. Obstaja veliko načinov in mehanizmov kako lahko fenotipska heterogenost poveča fitnes populacije. Mehanizmi heterogenosti so različni in jih v grobem lahko delimo na genetske in ne-genetske. Med ne-genetske heterogenosti populacije sodi heterogenost posameznih celic in je splošno razširjena med mikrobnimi populacijami. Nastane kot posledica stohastičnih nihanj, različnega mikrookolja, zgodovine posamezne celice in njene starosti. Drug primer pozitivnega vpliva heterogenosti so počasneje rastoče podpopulacije, ki vplivajo na dolgoročno preživetje populacije v primeru nenadnih sprememb razmer. Te pod-populacije imajo sicer trenutno manjši fitnes vendar so dolgoročno nujne za preživetje vrste. Še eden od mehanizmov, ki za samo celico ni ugoden je pa potreben za rast in razvoj celotne populacije je programirana celična smrt. Ta je udeležen pri procesih prelaganja sporulacije s pomočjo kanibalizma, reguliranje genetske raznovrstnosti z bratomorom, altruistična celična smrt v korist kolonizacije ali nastanka biofilma. Pomembna prednost fenotipske hetrogenosti, ki bi se jo lahko uporabilo v sintezni biologiji je da za njeno uporabo potrebno manjše poznavanje samega okolja, ko pri uporabi katere druge strategije.

Nadzorovanje genetske diverzifikacije

Sposobnost organizmov, da se preko mutacij in genetske variabilnosti prilagajajo selekcijskemu pritisku je ključnega pomena za njihovo preživetje. Zato bi se lahko kontrolirano genetsko diverzifikacijo lahko uporabilo za spodbujanje prilagodljivosti na spremenljivo okolje pri inženiringu organizmov. Celične linije s pogostejšimi mutacijami so se tako izkazale za uspešnejše pri prilagajanju na določene okoljske pogoje saj imajo koristne mutacije tako večje možnosti, da se izrazijo. Vendar to ni optimalna evolucijska strategija saj je večina mutacij še vedno negativnih. Naključnostni lokusi so hipermutirajoča zaporedja, ki spodbujajo prilagajanje na novo okolje tako, da uravnavajo izražanje genov. Genska variabilnost se namreč doseže preko mutacij v tandemskih ponovitvah saj tam prihaja do insercij in delecij veliko pogosteje kot drugje v genomu. V kolikor so ta zaporedja vključena v regulatorne regije promotorjev lahko vplivajo na pestrost transkripcije tako da spreminjajo razdaljo med -35 in -10 škatlami. V primeru, da so vnesena v kodirajoča zaporedja lahko vplivajo na izražanje z zamikom bralnega okvirja.

Kompromisi med različnimi kriteriji pri načrtovanju organizmov

Kompromisi so pri inženiringu novih organizmov nujno potrebni saj so v okolju v katerem se nahajajo viri omejeni. Problemi nastanejo zaradi kompleksnega okolja v katerem bo rešitev optimalna za določeno funkcijo neoptimalna za drugo. Predvsem je pomemben kompromis med celično rastjo in kemično sintezo v metabolnem inženirstvu. Saj lahko pri povečanem nastajanju produkta pride do zmanjšanja nastajanja biomase zaradi porabljanja ključih metabolitov, tekmovanja pri transkripciji in translaciji, neravnovesja med kofaktorji in akumuliranja toksičnih intermediatov. To je pomembno predvsem v biosintezav v šaržnih reaktorjih. Tukaj se da ta problem rešiti s preklopom med metabolizmom prilagojenim za rast in tistim prilagojenim za biosintezo. Tako počakamo, da celice dosežejo zadostno gostoto in nato preklopimo na proizvodnjo našega produkta. Vendar tak način ni primeren za trajno regulacijo v naravnih okoljih. Zato se poslužuje regulacije s povratno zanko, ki je izredno pogosto tudi v naravi. Problem pri regulaciji s povratno zanko je v temu, da razpolagamo z omejenim obsegom in pestrostjo poznanih bioloških senzorjev, ki bi lahko služili v ta namen. Zato se poizkuša uporabiti regulacijo na ravni celotnega genoma pri čemer se cilja na promotorje, ki jih regulirajo toksični intermediati katerih se želimo znebiti. Pri temu tako pride do začasne spremembe izražanja genov v metabolni poti.

Interakcije med sinteznimi potmi v celici in bazalnim metabolizmom

Kako bo gostiteljska celica opravljala novo funkcijo je odvisno tudi od prisotnosti bio-molekul potrebnih za transkripcijo in translacijo. Število ribosomov je na primer močno povezano s hitrostjo rasti celic. Samo število operonov za rRNA vpliva na fitnes celic v različnih okoljih. V okoljih kjer je prisotnost hranil konstantno nizka predstavlja manjše število operonov za rRNAa prednost za celico. V okoljih kjer pa količina hranil močno niha imajo prednost organizmi z večjim številom operonov rRNA kar kaže na to da gre za pomemben mehanizem prilagajanja celic na okolje. Vendar število ribosomov ni najprimernejši način regulacije metabolne aktivnosti gostiteljske celice. Eden od globalnih regulatorjev, ki bi lahko bili primerni za modeliranje proteoma je aktivnost RNA polimeraze (RNAP). Ugotovljeno je bilo, da nekatere mutacije na RNAP vodijo v povečano hitrost rasti preko sprememb v izražanju genov v celotnem genomu. Podobno kot RNAP je za regulacijo preživetje celic možno uporabiti sigma faktorje. Prisotnost različnih sigma faktorjev, ki se vežejo na specifične promotorje in tako spremenijo transkripcijsko stanje je ključnega pomena pri odzivu na stres in preživetju celic v stresnih pogojih. Razmerje med različnimi sigma faktorji tako vpliva fitnes celic v stresnem okolju. Nova logična vezja ki jih pri sintezni biologiji vstavljamo v genom, lahko za gostiteljsko celico predstavljajo pomembno energetsko breme in je posledica vseh komponent, ki so potrebne za delovanje takšnih vezij in jih more celica sintetizirati. To ima za posledico večje metabolne zahteve kar zmanjša učinkovitost opravljanja funkcije, ki jo želimo v celico vnesti prav tako pa zmanjša evolucijsko stabilnost organizma v okolju. Zato je smiselno zmanjšati število komponent, katere vnesemo v gostiteljsko celico. Eden od načinov za dosego tega cilja je razdelitev dela med več različnih celičnih pod-populacij ali celo med različne vrste organizmov. S tem lahko preprečimo pomanjkanje virov saj tako prerazporedimo tudi energetske potrebe celic med več različnih populacij. Pri tem je potrebno biti pozoren na ravnotežje med populacijami, ki opravljata vsak svojo funkcijo. Z delitvijo dela je mogoče povečati nabor nalog, ki jih lahko opravljajo sintezni organizmi in s tem razširiti njihovo uporabnost na nova področja. Naveza dveh metabolno zelo različnih vrst bakterij je sposobna razgradnje substratov, ki jih en sam organizem ne bi bil sposoben razgraditi zaradi termodinamskih omejitev. Sobivanje različnih populacij organizmov je doseženo tako, da vsak organizem zavzame svojo nišo v ekosistemu, kjer je njegova rast omejena s specifičnimi okoljskimi dejavniki. Različni profili izkoriščanja virov, različne afinitete organizmov do substratov in različna poraba vodijo v boljše izkoriščanje virov iz okolja. Za načrtovanje tovrstnih ekosistemov je pomembno zavedanje, da organizmi znotraj vrste in med različnimi vrstami med seboj ne le tekmujejo ampak tudi sodelujejo. Zaradi medsebojnega sodelovanja med organizmi so se med številnimi vrstami razvili reducirani genomi zaradi česar je preživetje številnih vrst odvisno od drugih organizmov. Cilj tovrstnega inženiringa organizmov je stabilna integracija v ekosistem, za kar je potrebno doseči evolucijsko stabilno stanje. To je evolucijsko stanje v katerem vse deviacije v strukturi populacije lahko le zmanjšajo fitnes vsakega organizma. S tem je tudi preprečeno razširjanje organizmov, ki so na začetku prisotni v majhnem številu. Zato je smiselno, da pri uvajanju sintetičnega organizma v okolje poskušamo s tem čim manj spremeniti strukturo populacij v ekosistemu.

Sintezna ekologija

Sintezna ekologija je veja sintezne biologije pri kateri kombiniramo populacije različnih organizmov za opravljanje želene funkcije. Pri tem med seboj kombiniramo organizme, ki sicer v naravi ne sobivajo. Pri temu je glavni izziv sintezne ekologije doseči dolgoročno obnašanje na ekološkem nivoju. Po eni od hipotez naj bi stabilno stanje v ekosistemu nastalo, ko je tekmovanje znotraj vrste večje od tekmovanja med vrstami. Z mikrobnimi združbami je mogoče manipulirati preko spreminjanja pogostosti določenih organizmov, z okoljskimi signali ali s inženiringom organizmov.

Ob temu, da se poizkuša ustvariti organizme, ki bi se v okolju obnašali kar se da stabilno je potrebno pomisliti tudi na nenadzorovano uhajanje teh organizmov v okolje. Pri tem gre predvsem za nenadzorovano širjenje organizmov in horizontalen prenos genov. Zato je potrebno razviti varnostne mehanizme, ki bi preprečevali nenadzorovano širjenje organizmov ali genskega materiala. Mednje sodijo sintezna auksotrofija, odvisnostni plazmidi in organizmi s spremenjenim genskim kodom.

Zaključek

Načrtovane mikrobne združbe, ki so vključene v naravno okolje morejo biti sposobne ohranjati fiziološko aktivnost ter biti ekološko in gentsko stabilne skozi daljše časovno obdobje. V prihodnosti bo za učinkovitejše načrtovanje v kompleksnih okoljih potrebno razviti različna orodja. Učinkovite simulacije okolja, ki bodo omogočale obdelavo velikega števila parametrov z visoko natančnostjo. Razširiti bo potrebno nabor kontrolnih mehanizmov za nadzorovanje celične fiziologije in zaznavanje virov. Izboljšati bo potrebno računske modele za celično rast in delovanje ekosistemov, ki bodo omogočali načrtovanje stabilnih mikrobnih združb.

Viri

Ophelia S. Venturelli, Robert G. Egbert in Adam P. Arkin, Towards engineering biological systems in a broader context, Journal of Molecular Biology, 2015

Zhang H, Lin M, Shi H, Ji W, Huang L, Zhang X, et al. Programming a Pavlovian-like conditioning circuit in Escherichia coli. Nat Commun 2014;5:3102

Cardinale S, Joachimiak MP, Arkin AP. Effects of genetic variation on the E. coli host-circuit interface. Cell Rep 2013;4:231–7