Uvod

Ciklično regulirana transkripcija genov igra pomembno vlogo pri usklajenem delovanju kompleksnih bioloških sistemov. Raziskovalci na področju sintezne biologije si z razvojem genetskih oscilatorjev prizadevajo rekonstruirati zapletena celična obnašanja na podlagi osnovnih biokemijskih mehanizmov izražanja genov in biokemijskega signaliziranja[1]. V predhodnih raziskavah je raziskovalcem uspelo razviti sisteme oscilatorjev, pri katerem so uspešno sprogramirali amplitudo in frekvenco genetskih ur posameznih celic, ni pa jim uspelo doseči usklajenega obnašanja v celični populaciji. Opazili so, da se celice po nekaj ciklih pričnejo obnašati neodvisno in oscilirati izven faze, saj vsaka celica sledi svoji lastni genetski uri. Raziskovalci z univerze v San Diegu so v raziskovalnem članku z naslovom A synchronized quorum of genetic clocks kot metodo uravnavanja skupnega časa vseh celičnih ur v populaciji uporabili bakterijski sistem zaznavanja celične gostote [1,2,3].

Zasnova bioloških delov genetskega oscilatorja

Genetski oscilator je bil zasnovan iz elementov sistema zaznavanja celične gostote iz V. fischeri in B. thuringiensis. V raziskavi so skonstruirali 3 enake transkripcijske module, ki so zgrajeni iz zaporedja RBS in terminatorja iz modula na pZ plazmidu, promotorske regije operona lux iz bakterije V. fischeri ter zapisa za protein, ki ima dodano ssrA C-končno oznako TSAANDENYALAA, pri kateri TS segment predstavlja restrikcijsko mesto za SpeI, preostalo zaporedje pa cepitveno mesto za bakterijski endopeptidazni kompleks ClpX. Slednja modifikacija proteinov je zmanjšala njihove razpolovne dobe v celici, kar je omogočalo hitrejše prehode sistema v fazah oscilacije. Vsakemu modulu sledi še naravni konstitutivni generator proteina LuxR iz lux operona bakterije V. fischeri, kar zagotavlja zadostno koncentracijo proteina LuxR v celici [1,3]. Prvi modul LuxI predstavlja generator proteina AHL-sintaze, ki pretvarja S-adenozilmetionin (SAM) v signalno molekulo acilhomoserinlakton (AHL), in v vezju deluje kot pozitivna povratna zanka. yemGFP modul, ki se skupaj s prvim nahaja na istem »aktivatorskem«/reporterskem plazmidnem ogrodju(pTD103luxI/GFP), generira optimizirano obliko reporterskega proteina GFP, ki ima izboljšano rabo kodonov za izražanje v kvasovkah in vsebuje F64L/S65T/A206K mutacije, ki povečajo intenziteto fluorescence GFP ter preprečujejo tvorbo dimerov, kateri naj bi zavirali rast bakterijskih kolonij E. coli. Modul AiiA, ki se nahaja na »represorskem« plazmidnem ogrodju(pTD103aiiA), pa zapisuje za metaloencim iz družine laktonaz, ki razgrajujejo signalno molekulo AHL, in tvori negativno povratno zanko v vezju. Oba plazmida poleg komponent vezja vsebujeta tudi zapisa za različni selekcijski marker in različna mesta ori. S tem se plazmid z yemGFP/LuxI moduloma zaradi mesta ori CoIE1 v celici nahaja v večjem številu kopij(~15-20) kot plazmid z modulom AiiA(~10 kopij), ki nosi zapis za mesto ori p15A. Z pripravljenima vektorjema so transformirali celice E. coli seva MG1655 in izvedli ustrezno selekcijo kolonij, ki so sprejele oba konstrukta [1,3,4].

Metode in tehnike

V testiranju načrtovanih genetskih vezij v celičnih kulturah so v sintezni biologiji v uporabi mikrofluidne naprave, ki s pomočjo mikroskopa omogočajo spremljanje obnašanja sistema na nivoju kolonij ali posameznih celic[5]. Raziskovalci iz San Diega so pri svoji študiji uporabili 3 različice omenjenih naprav, ki jih v osnovi sestavljajo rastne komore in osrednji kanal, preko katerega se v sistem vnese celično kulturo, ki se ujame v rastne komore, in se jo preko stalnega pretoka preskrbuje z svežim medijem z ali brez dodanega detergenta, ki preprečuje adhezijo celic na površine, ob tem pa se njihove odpadne produkte odvaja naprej po kanalu v odpad. Osrednji sistem je postavljen med dve površini iz pleksistekla, preko katerih se uravnava konstantna temperatura gojenja 37°C. Z uporabo mikrofluidne naprave so v sistemu uspešno vzdrževali eksponentno fazo rasti bakterijskih celic za več kot 4 dni, kar jim je omogočalo spremljanje oscilacij sistema preko daljšega časovnega obdobja [1,3].

Modeliranje

Simulacije obnašanja in modeliranje na podlagi eksperimentalnih opažanj sta pomembni stopnji v procesu načrtovanja in optimiziranju delovanja vezja. Za kvantitativni opis sinhronizacije oscilacije v večcelični populaciji so v raziskavi uporabili model genetske ure na podlagi zaznavanja celične gostote s setom parcialnih diferencialnih enačb, ki opisujejo spreminjanje koncentracij proteinov LuxI in AiiA ter koncentracij AHL v in izven celice med oscilacijami. Analizirali so tudi časovno-prostorsko dinamiko genetskih ur. Pri tem so predpostavili model individualnih oscilatorjev, ki so bili sklopljeni preko zunajcelične koncentracije AHL. Predvideva enodimenzionalni niz celic, katero se vsako posebej opiše s setom diferencialnih enačb in katere oscilacije se sklopi z skupnim nehomogenim poljem zunajceličnega AHL, ki lahko preko celične membrane prosto prehaja v ali izven celice [1].

Rezultati

Časovne oscilacije v testnem sistemu

V prvem delu raziskave so avtorji članka z namenom testiranja delovanja oscilatorja uporabili mikrofluidno napravo s pravokotnimi rastnimi komorami, ki so postavljene prečno glede na osrednji kanal in zaradi njihovih dimenzij omogočajo rast celicam v eni plasti. Ob delitvah se celice, najbližje osrednjem kanalu, izpostavijo pretoku, ki jih odnese proti odpadu. Opazili so, da so po krajši začetni fazi brez oscilacij celice v takšnem sistemu pričele stabilno oscilirati in da s časom ni prišlo do razklopitve oscilacij. Mehanizem oscilacije na podlagi biološkega vezja v rastni komori lahko obrazložimo z delovanjem pozitivne povratne zanke gena LuxI in negativne povratne zveze AiiA. Ob pričetku cikla je koncentracija AHL nizka, saj se AHL odstrani s šibkim pretokom v osrednjem kanalu ali pa se razgradi z AiiA. Populacija celic na začetku preko bazalne ravni izražanja LuxI zaradi puščanja Lux promotorja še ni sposobna tvoriti zadostne količine induktorja za aktivacijo transkripcije genov pod promotorjem lux. Po določenem času se z celičnimi delitvami doseže kritična celična gostota, ki z dovolj visoko lokalno koncentracijo AHL sproži hipen porast ravni transkripcije genov LuxI, AiiA in yemGFP. Po časovnem zamiku, odvisnem od hitrosti transkripcije, translacije in zvijanja proteinov, fluorescenca narašča, dokler AiiA, ki nastaja vzporedno, ne razgradi dovolj AHL, da se transkripcija omenjenih genov zavre. Z eksponentnim padanjem koncentracije AiiA postopno upade tudi razgradnja AHL, kar omogoča celicam v rastni komori vstop v nov cikel oscilacije [1]. Ob testih delovanja oscilatorja pri različnih velikostih komor in širin osrednjega kanala so analizirali tudi učinkovitost odstranitve AHL v sistemu ob določenih hitrostih pretoka skozi glavni kanal, saj ta vpliva na hitrost odplavljanja AHL iz komore. Ugotovili so, da ob naraščajoči hitrosti pride do višje amplitude in daljše periode oscilacije, in da pri tem signal fluorescence ob vračanju na začetno stanje ne doseže bazne linije. Pokazali so tudi, da je amplituda oscilacij izkazovala premo-sorazmernost s periodo oscilacij, kar je bilo opaženo tudi pri predhodno načrtanem znotrajceličnem oscilatorskem vezju, ki so ga opisali Stricker in sodelavci [1,3].

Časovna dinamika vzdolžnega prenosa motnje

Po uspešnem testiranju delovanja oscilatorskega vezja so se avtorji članka nadaljnje usmerili v analizo vzdolžnega prenosa motnje. V ta namen so uporabili drugačno mikrofluidno napravo, ki ima podaljšano rastno komoro, kar skupaj s širšim osrednjim kanalom povzroči, da so celice direktno izpostavljena počasnem pretoku skozi kanal. Izolirane kolonije, ki jih v sistem vnesemo ob pričetku eksperimenta, rastejo in se združujejo v tesen sloj celic, ki zapolnijo celoten prostor v komori. Raziskovalci so pri izvedbi eksperimenta opazili, da na določeni točki v časovnem intervalu pride do izbruha fluorescence, ki se širi v obe smeri rastne komore in potuje proti njenim robovom. Pod takimi pogoji transport hranil, AHL in odpadnih produktov poteka pretežno preko difuzije, zato smer pretoka ne vpliva na smer širitve motnje [1]. Ko se potujoči val približuje robu komore, se njegova hitrost upočasni, saj doseže območja z nižjo gostoto celic od optimalne. Pri nizki celični gostoti na robovih kulture ni oscilacij, saj celični AHL difundira preko membrane izven rastne komore v osrednji kanal in nato potuje v odtok. Po določenem času pride v bližini lokacije prvotnega izbruha do proženja nove motnje, ki analogno potuje v obe smeri komore. Prihaja tudi do pojavov trka in izničenja valov fluorescence, ki potujejo v nasprotno smer, ter do postopne izgube koherence oscilacij zaradi nehomogenosti celične gostote in zaradi lastne nestabilnosti prenosa motnje. Opažene rezultate so ustrezno proizvedli tudi z modeliranjem individualnih oscilatorjev, ki so sklopljeni preko zunajcelične koncentracije AHL, kjer je hitrost motnje odvisna od difuzijskega koeficienta za AHL in celične gostote [1].

Časovna dinamika prenosa motnje v prostoru

V naslednjem koraku so sistem iz enodimenzionalnega širjenja motnje razširili na analizo širjenja motnje preko dvodimenzionalnega prostora. V ta namen so gojili bakterijsko kulturo v mikrofluidni napravi, ki preko večje rastne komore omogoča rast kolonije v vse smeri. Opazili so radialno rast kolonij brez fluorescence do premera kulture približno 100 μm. Sledil je izbruh fluorescence blizu centra kulture, nastala motnja pa se je širila navzven z najvišjo intenzivnostjo v območjih, po vrednosti celične gostote med centrom in zunanjostjo kulture, kar nakazuje na višjo amplitudo oscilacije omenjenih celic. Nadaljnji izbruhi fluorescence se podobno pričnejo na obročih vmesne celične gostote ob rasti celične kulture navzven. V centru kulture se pojavljajo manjši izbruhi, ki pa hitro zamrejo, kar raziskovalci ustrezno pojasnijo z modeliranjem s funkcijo celične gostote v obliki mehiškega klobuka, ki določa, da so oscilacije na področju visoke gostote celic na sredini zavrte, na periferiji rastoče kolonije pa se pojavljajo izbruhi LuxI [1].

Zaključek

Uporaba sistemov zaznavanja celične gostote je uporabna metoda pri povečevanju občutljivosti in robustnosti dinamičnega odziva na zunanje signale. Rezultati raziskovalcev iz San Diega odpirajo nove možnosti načrtovanja vezij, ki lahko delujejo kot prostorsko ločeni senzorji ali kot sintezna ogrodja za sklopitve zapletenih dinamičnih procesov v večceličnih sistemih.