Ojačanje humoralne in T-celične CD8+ imunosti v miškah cepljenih s cepivom DNA proti človeškemu respiratornemu sincicijskemu virusu z usmerjanjem kodiranega proteina F na dendritske celice
Humani respiratorni sincicijski virus (RSV) je virus, ki povzroči vnetje spodnjega dela dihal (traheja, primarni bronhiji in pljuča). Za okužbo so najbolj dovzetni dojenčki, otroki, posamezniki z oslabljenim imunskim sistemom in starejši ljudje. Vrh okužbe virus dosega v zimskih mesecih. Oseba, ki preboli RSV pridobi le kratkoročno imunsko zaščito in je tako čez čas ponovno dovzetna za okužbo. Virus se prenaša z dotikom in ostane na koži viabilen do pet ur. Po štirih do petih dneh inkubacijske dobe se pri odraslih pričnejo kazati simptomi nahoda, med tem ko se lahko pri otokih mlajših od enega leta razvije bronhiolitis oziroma gripa. Za omenjen virus trenutno obstaja le eno registrirano zdravilo-Palivizumab. Palivizumab je preventivno zdravilo in vsebuje monoklonska protitelesa proti fuzijskemu glikoproteinu RSV (RSV F). RSV F spada v tip 1 transmembranskih proteinov in sproži fuzijo med virusno in celično membrano s čimer omogoči vstop nukleokapside v citoplazmo. Zaradi njegove pomembne vloge pri okužbi in izredno ohranjenega aminokislinskega zaporedje se je izkazal kot odlična tarča za zdravljenje s protitelesi. Kitajski znanstveniki so se lotili problema RSV z razvojem cepiva DNA, ki je bilo osnovano na pVAX1 vektorju in je vseboval zaporedje scDEC205, sF in oznako His. scDEC205 je zaporedje DNA, ki zapisuje za variabilno domeno protitelesa proti receptorju DEC205. DEC205 je eden najbolj pomembnih receptorjev dendritskih celic, ki sproži imunski odziv in spada v družino tipa-C lektinskih receptorjev. Njegova vloga je privzem ter prezentacija antigena. Antigeni, ki se zelo dobro vežejo na CD205, imunske celice zelo dobro procesirajo in predstavijo na MHC 1 oziroma MHC 2, s tem pa se izboljša humoralna in/ali celična imunost. sF zaporedje zapisuje za zunajcelični del transmembranskega proteina F. Tako osnovano cepivo je uspešno dostavilo protein F RSV-ja do dendritskih celic, ki so ga internalizirale in nato prezentirale na površini. Po prezentaciji so se uspešno aktivirale celice ubijalke in celice Th1.
Sestava in kloniranje konstrukta
Zapis za težko in lahko variabilno domeno protitelesa proti mišjemu DEC205 (scDEC) so pridobili s PCR pomnoževanjem plazmidov, ki so že vsebovale omenjen zapis. Posamezna zapisa so združili preko (G4S)4 povezovalca. Vzporedno so sestavili zapis za kontrolno izotopno variabilno domeno protitelesa (scISO). Na C koncu »protiteles« so nato preko (G4S)4 povezovalca dodali še optimizirano zaporedje sF in na njegovem 3' koncu oznako His. Tako sestavljena konstrukta sta bila klonirana v pVAX1 vektorja.
Transfekcija in validacija izražanja rekombinantih proteinov
Izražanje rekombinantnih proteinov so validirali s transfekcijo celic 293T. Transficirane celice so lizirali in lizat analizirali z SDS-PAGE-om ter s prenosom western.
Validacija vezave rekombinantnih proteinov na receptor DEC205
Supernatant transficiranih celic 293T so centrifugirali in s tem odstranili celične ostanke. V tekočini so ostali rekombinantni proteini, ki so jih nato inkuburali z normalnimi celicami CHO in celicami CHOmDEC205, ki so na površini izražale receptor DEC205. Celice so sprali in nato inkubirali z monoklonskimi protitelesi proti RSV F. Po inkubaciji je ponovno sledilo spiranje in inkubacija s sekundarnimi protitelesi. Po spiranju so izvedli pretočno citometrijo in potrdili vezavo rekombinantnih proteinov na receptor DEC205.
Testiranje zmožnosti celic DC2.4, da vežejo in internalizirajo rekombinantne proteine
Za testiranje zmožnosti celic DC2.4, da vežejo in internalizirajo rekombinantne proteine so očiščene rekombinantne proteine inkubirali skupaj s celicami DC2.4. Po inkubaciji so celice najprej označili s primarnimi protitelesi proti RSV F in nato še s sekundarnimi protitelesi konjugiranimi z PE-jem. Po označevanju so izvedli pretočno citometrijo in potrdili vezavo rekombinantnih proteinov na celice DC2.4.
Za izvedbo konfokalne mikroskopije so celice označili z enakimi primarnimi in sekundarnimi protitelesi kot pri prejšnji metodi ter še dodatno z FITC-faloidinom in DAPI-jem. Mikroskopija je potrdila internalizacijo rekombinantega proteina.
Validacija cepiva in-vivo
Za in-vivo validacijo so miške vsake tri tedne immunizirali z vbizganjem različne količine cepiva v nožno mišico in elektroporacijo. S testom ELISA so potrdili prisotnost RSV-specifičnih igG-jev. Prav tako so potrdili celice ubijalke specifične za RSV in aktivacijo Th1 celic.
