Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola

Engineering of a microbial coculture of Escherichia coli strains for the biosynthesis of resveratrol

Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mexica so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic E.coli.

Biosinteza resveratrola

Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina ali L-fenilalanina v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) pretvarja L-tirozin v p-kumarinsko kislino (p-CA), encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza) pa katalizirata pretvorbo L-fenilalanina v p-CA. Le-ta se potem nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).

Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic E.coli

Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA in malonil-CoA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu E.coli W3110. Celice za proizvodnjo p-CA (W(pheA-)Rg) vsebujejo vektor z zapisom za TAL (iz kvasovke R.glutinis) in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA, ki omogočata izražanje na povratno inhibicijo neobčutljivih encimov DAHP-sintaze in transketolaze. Celice imajo inaktiviran gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin), zato celice večino prefenata pretvorijo v L-tirozin, ki je substrat za encim TAL.

Celice za pretvorbo p-CA do resveratrola (W-Vv) nosijo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma S. coelicolor, tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz A.hypogaea in V.vinifera).

Rezultati

Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz V.vinifera, ki so rastle v mediju z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz V.vinifera višja v primerjavi z STS iz A.hypogaea. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v prisotnosti glicerola. Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.

Kokultura iz dveh populaciji celic E.coli (W(pheA-)Rg in W-Vv, razmerje 1:1) proizvede v enostavnem gojišču z glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v enostavnem gojišču v podobnem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo, vendar je potrebno v gojišče dodajati intermediate (npr. p-CA), kvasni ekstrakt ali inhibitorje encimov.

Zaključek

Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo v gojišče ni potrebno dodajati kvasnih ekstraktov, specifičnih inhibitorjev in intermediatov biosintezne poti. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo lahko izboljšali pretok molekul med obema populacijama in tako še povečali proizvodnjo.

Viri

1. J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of Escherichia coli strains fort he biosynthesis of resveratrol.” Microbial cell factories 2016, 15, 1-11.
2. A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered Escherichia coli.” Microbial cell factories 2015, 14, 1-12.
3. J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” Oxidative medicine and cellular longevity 2015, 2015, 1-13.