Inženiring mikrobne kokulture dveh sevov Escherichia coli za biosintezo resveratrola
Engineering of a microbial coculture of Escherichia coli strains for the biosynthesis of resveratrol
Resveratrol je polifenolna spojina, ki jo izločajo nekatere rastline kot odziv na fizično poškodbo ali okužbo s patogeni. Ker je močen antioksidant, naj bi imel številne pozitivne učinke na zdravje človeka. Redno uživanje naj bi zmanjšalo tveganje za razvoj srčno-žilnih bolezni, hkrati pa mu pripisujejo tudi nevroprotektivni, protivnetni in antimikrobni učinek. Naravno je prisoten v grozdju, gozdnih sadežih in arašidih, vendar se tam nahaja v majhnih količinah. Boljši način vnosa predstavljajo prehranska dopolnila, ki večinoma temeljijo na resveratrolu, izoliranem iz rastlin. Ekstrakcija resveratrola iz rastlinskih tkiv zahteva več stopenj čiščenja in daje nizek izkoristek. Za namene pridobivanja te spojine so se razvili biotehnološki sistemi, ki večinoma temeljijo na monokulturah. Raziskovalci iz Mehike so razvili mešano kulturo za proizvodnjo resveratrola, pri čemer so biosintezno pot razdelili med dve različni populaciji celic E.coli.
Biosinteza resveratrola
Rastline sintetizirajo resveratrol iz L-tirozina ali L-fenilalanina v večstopenjski reakciji. Encim TAL (L-tirozin amoniakliaza) katalizira pretvorbo L-tirozina v p-kumarinsko kislino (p-CA), p-CA pa nastaja tudi iz L-fenilalanina, pri čemer sodelujeta encima PAL (L-fenilalanin amoniakliaza) in C4H (cinemat 4-hidroksilaza). p-CA se nadalje pretvori v trans-resveratrol z encimoma 4CL (4-kumaroil-CoA ligaza) in STS (stilben sintaza).
Razdelitev biosintezne poti med dve populaciji celic E.coli
Raziskovalci so biosintezno pot resveratrola razdelili v dva modula. Prvi je obsegal pretvorbo glicerola ali glukoze do p-CA, drugi pa pretvorbo p-CA v trans-resveratrol. Obe populaciji celic, ki so jih uporabili, temeljita na sevu E.coli W3110. Ker bakterije E.coli nimajo vseh potrebnih komponent za biosintezo resveratrola, je bilo potrebno vanje vnesti tuje gene za manjkajoče encime. Ti so večinoma izvirali iz različnih rastlinskih vrst, pa tudi iz nekaterih mikroorganizmov in so bili ustrezno modificirani za izražanje v E.coli.
Celice za proizvodnjo p-CA (sev W(pheA-)Rg) vsebujejo vektor zapisom za TAL (iz kvasovke R.glutinis) in vektor z modificiranima genoma aroG in tktA (iz E.coli). Pri izražanju teh genov nastaneta DAHP-sintaza in transketolaza, ki nista občutljivi na povratno inhibicijo. Encima sta del osnovne metabolne mašinerije celic in sodelujeta pri nastanku prekurzorja šikimatne poti (DAHP). Intermediat šikimatne poti prefenat pa se v bakterijskih celicah pretvarja v L-fenialanin ali L-tirozin. Cilj raziskovalne ekipe je bil, da celice proizvajajo čim več L-tirozina, ki je substrat za encim TAL. Celicam so zato inaktivirali gen pheA (usmerja pretvorbo prefenata v L-fenilalanin). p-CA, ki nastane po delovanju TAL, se izloča v gojišče, od koder jo prevzemajo celice druge populacije. Celice za pretvorbo p-CA do resveratrola (sev W-Vv) nosijo plazmid z zapisoma za 4CL in STS. Raziskovalci so uporabili zapis za 4CL iz mikroorganizma S. coelicolor, tekom raziskave pa so testirali 2 rastlinska gena za STS (iz A.hypogaea in V.vinifera).
Rezultati
Najvišje koncentracije resveratrola v titru so zaznali pri celicah z zapisom za STS iz V.vinifera, ki so rastle v gojišču z dodanim glicerolom. Z SDS-PAGE so pokazali, da je raven izražanja proteina STS iz V.vinifera višja v primerjavi z STS iz A.hypogaea. Ne glede na različico STS so celice proizvajale več resveratrola v gojišču z glicerolom (v primerjavi z glukozo) . Razlog za to je najverjetneje večja aktivnost encima STS. V prisotnosti glukoze celice namreč proizvajajo več acetil-CoA, ki deluje kot kompetitivni inhibitor STS.
Kokultura dveh populaciji celic E.coli (W(pheA-)Rg in W-Vv; razmerje 1:1) proizvede v enostavnem gojišču M9 z dodanim glicerolom 22,6 mg/L resveratrola. Znane monokulture v enostavnem gojišču v podobnem času proizvedejo manjše količine resveratrola (v območju med 3,6 in 16 mg/L). Sicer obstajajo sistemi, ki omogočajo večjo proizvodnjo (tudi do 2340 mg/L), vendar je potrebno v gojišče dodajati kvasne ekstrakte, intermediate (npr. p-CA) in/ali inhibitorje encimov, ki usmerjajo celični metabolizem v želeno smer.
Zaključek
Raziskovalci so pripravili prvo kokulturo, ki omogoča proizvodnjo resveratrola iz glicerola v enostavnem gojišču. Kokultura daje boljše izkoristke v primerjavi z številnimi že znanimi monokulturami, celice proizvajajo resveratrol iz enostavne organske molekule, poleg tega pa za učinkovito proizvodnjo zadostuje minimalno gojišče brez dodatkov. Avtorji članka so prepričani, da bi z optimizacijo lahko izboljšali pretok molekul med obema populacijama in tako še povečali proizvodnjo trans-resveratrola.
Viri
- J.M. Camacho-Zaragoza et al. ‟ Engineering of a microbial coculture of Escherichia coli strains fort he biosynthesis of resveratrol.” Microbial cell factories 2016, 15, 1-11.
- A. Vargas-Tah et al. ‟ Production of cinnamic and p-hydroxycinnamic acid from sugar mixtures with engineered Escherichia coli.” Microbial cell factories 2015, 14, 1-12.
- J. Gambini et al. ‟ Properties of resveratrol: In vitro and in vivo studies about metabolism, bioavailability, and biological effects in animal models and humans ” Oxidative medicine and cellular longevity 2015, 2015, 1-13.
