No problem

povzeto po projektu IGEM skupine [NCKU Tainan, 2017]

(Marija Srnko)

IGEM ekipa NCKU Tainan, se je na IGEM tekmovanju 2017 lotila ekološkega problema, ki zadeva onesnaženost voda. Prekomerna koncentracija nitrata v vodi, namenjeni gojenju rib lahko povzroči zmanjšan prirastek oziroma v skrajnih primerih tudi smrt organizmov. Najpreprostejši in najcenejši ukrep za izogib težavam, je zamenjava umazane vode s podzemno vodo. Vodilo projekta NO problem je bila tako izgradnja oziroma sinteza biološkega sistema, ki bi bil sposoben zaznavati ter odstranjevati nitrat iz voda.

Senzorsko napravo predstavlja čoln opremljen z motorje in GPS napravo, ki omogočata njegovo natančno usmerjanje. Čoln vsebuje termometer, pH meter ter sistem za zaznavo koncentracije nitrata v vodi. Črpalke in nadzorovani ventili prečrpajo točno določeno količino vode v cevko, kjer se nahajajo liofilizirane celice E.coli. Liofilizirane celice so uporabili zaradi krajšega odzivnega časa. Po dovodu vode z določeno koncentracijo nitrata so signal z liofiliziranimi celicami zaznali po 20 minutah, medtem ko so signal v primeru tekoče celične kulture zaznali po štirih urah. Cevko, ki absorbira svetlobo, osveti laser s svetlobo valovne dolžine 450 nm. Prisotnost nitrata povzroči sintezo zelenega fluorescenčne proteina, ki fluorescira svetlobo valovne dolžine 510 nm in jo zazna detektor sklopljen s procesorjem. Spremembo intenzitete se beleži, kot sprememba napetosti. Povezava z podatkovno bazo, pa omogoča hitro procesiranje ter posledično hitrejše vzorčenje (pogostejši intervali). Rezultati analize se prenesejo na server ter od tam v mobilno aplikacijo. Uporabniku so rezultati analize na voljo v okoli 20 minutah. Analiza vode je tako mnogo krajša kot sedanja analiza, pri kateri je potreba vzorec vode poslati v analitske laboratorije.

Mobilna aplikacija omogoča grafično spremljanje temperature in pH vode ter koncentracijo nitrata. Prav tako omogoča usmerjanje čolna oziroma napotitev na specifično lokacijo ter reguliranje regulacijske škatle ter shranjevanje preteklih meritev. Po sprejetju signala (ga sproži uporabnik preko mobilne aplikacije oziroma se aktivira sama ob zaznani povišani koncentraciji nitrata), ki prične regulacijska škatla delovat po naslednjem mehanizmu. Črpalke prečrpajo vodo v regulacijsko škatlo. V regulacijski škatli pretočni sistem s filtri omogoči fizično očiščenje vode (filtracija). Čista voda se nato zbere v koritih, kjer poteče ob pomoči bakterijskih celic pretvorba nitrata v glutamin. Analiza očiščene vode je pokazala, da se odstrani do 98 & nitrata.

Detekcija nitrata

Za detekcijo nitrata so uporabili biokocko K381001 (BCCS-Bristol, 2010). Biokocka je nitratni reporter s promotorjem yeaR, močnim RBS ter GFP reporterskim genom. Aktivnost promotorja regulirata dva proteina, ki sta naravno prisotna v E.Coli, in sicer NsrR in NarL. Vezan protein NsrR ovira vezavo RNA polimeraze. Vezava nitrata oziroma dušikovega oksida pa povzroči njegovo sprostitev in DNA ter aktivacijo transkripcije. Aktivacijo promotorja sproža tudi fosforiliran NarL. Forsforilacija NarL proteina poteče ob prisotnosti nitrata oziroma dušikovega oksida. Lin in sodelavci so pokazali, da je aktivacija PyeaR odvisna od kombinacije aktivacije s fosforiliranim NarL in represije z NsrR proteinom [Lin, 2007].

V teoriji biokocka BB_K381001 v odsotnosti nitrata ne bi smela fluorescirat, a so poskusi pokazali, da prihaja v manjši meri do emitiranje fluorescence tudi v odsotnosti aktivacijskega signala. Da bi zmanjšali šum ter izboljšali občutljivost detekcije nitrata so biokocki BB_K381001 dodali vezavno mesto za NsrR. S tem so želeli povečali represijo transkripcije v odsotnosti nitrata. Dodatno vezavno mesto so v prvem primeru vnesli pred in v drugem primeru za RBS. Oba konstrukta sta v odsotnosti nitrata emitirala fluorescenco nižje intenzitete, v primerjavi z biokocko K381001. Boljši med omenjenima, pa je bil konstrukt z dodanim zaporedjem za RBS. Uspešnost spremenjene biokocke za zaznavo nitrata so preverili, tako da so liofiliziranim celicam E. coli dodali gojišča z različnimi koncentracijami nitrata ter merili intenziteto emitirane svetlobe. S poskusom so pokazali, da je z novo biokocko moč zaznati tudi koncentracije manjše od 10 nM. Slednji podatek je ključen predvsem iz stališča, da so maksimalne koncentracije nitrata v ribogojnih vodah v 1 mM območju.

Regulacijska naprava

Do sedaj je najpreprostejši in najcenejši način odstranjevanje nitrata iz ribogojnih voda zamenjava vode, kar pa predstavlja veliko breme za okolje. Da bi rešila omenjen problem je IGEM ekipa NCKU Tainan pripravili modificirane E.coli, ki so sposobne pretvarjati nitrat v glutamin.

1. Pretvorba nitrata v nitrit Pretvorba zahteva prisotnost minimalno štirih encimov v štiri stopenjski reakciji. V prvi stopnji nitratna reduktaza (NaR) pretvori nitrat v nitrit. Skupina genov, ki zapisujejo za NaR je naravno prisotna v divjem tipu E.coli MG1655. Celice so gojili v gojiščih z različnimi koncentracijami nitrata ter spremljali upad koncentracije v določenem časovnem obdobju. Z Greissovo reakcijo so določili, da je odstotek pretvorbe nitrata v nitrit v območju 18-30 %.

2. Pretvorba nitrita v amonijak Pretvorbi nitrata v nitrit sledi pretvorba nitrita v amonijak. Reakcijo vrši nitrit reduktaza (NiR), ki jo zapisuje gen nirBD. Gen je prav tako naravvno prisoten v E.coli MG1655, vendar je aktivnost samo 0.052 µmol/min/mg. Da bi povečali količno NiR v citoplazmi so s pomočjo primerjev izolirali gene, ki zapisujejo za NiR ter jih preko restrikcijskih mest HindIII in SpeI vstavili v vektor pSB1C3, kjer se izražajo pod močnim promotorjem PLacI. Vektor pSB1C3 vsebuje tudi mesto ori pUC, ki zagotavlja veliko ptevilo kopij plazmida. Na tak način so sintetizirali novo biokocko BB_K2275007. Po transformaciji E.coli MG1655 so v gojišče dodali različne koncentracije nitrata ter z Griessovim testom dokazali upad nitrata v gojišču ter delovanje biokocke BB_K2275007.

3. Pretvorba amonijaka v glutamat Tudi encim za to stopnjo pretvorbe je naravno prisoten v E.coli, a so zaradi dvakrat večje aktivnosti glutamat dehidrogenaze v Bacillus subtilis uporabili encim iz slednjega organizma. V zaporedje gudB so vnesli restrikcijski mesti BamHI in PstI ter zaporedje ligirali v vektor pSB1C3. Tako so pripravili biokocko BB_K2275008, kjer se glutamatna dehidrogenaza izraža pod PLacI. E. coli MG1655 transformirane z BB_ K2275008 so lizirali ter z NaDS-PAGE dokazali izražanje encima. Kljub temu da so protein zaznali pretežno v celičnem peletu so uspeli dokazat njegovo aktivnost, pretvorbo amonijaka v glutamat.

4. Pretvorba glutamata v glutamin Zadnja regulacijska stopnja je pretvorba glutamata v glutamin, ki jo vrši glutamin sintetaza. Sintetizirali so novo biokocko BB_K2275009. Ponovno so uporabili vektor pSB1C3 ter vanj s pomočjo restrikcijskih mest HindIII in PstI vključili gen glnA (zapis za glutamin sintetazo) iz Pseudomonas putida. V nasprotju z glutamat dehidrogenazo se je glutamin sintetaza po liziranju celic nahajala pretežno v supernatantu. Z kalorimetričnim testom za detekcijo glutamina so pokazali, da se glnA lahko uspešno izraža v E. coli MG1655 ter vrši pretvorbo glutamata v glutamin.

Prav tako so pripravili biokocko K2275010 v katero so v isto ogrodje vnesli zaporedje gudB in glnA. Uspešno izražanje in aktivnost obeh proteinov v E.Coli MG1655 in torej uspešno pretvorbo amonijaka v glutamin so ponovno dokazali s kalorimetričnim testom za detekcijo glutamina. Delovanje celotne regulacijske poti so preverili, tako da so celice E. coli MG1655 transformirali s plazmidoma BBa_K2275007 in BBa_K2275010. Celicam so po 12 h urah gojenja dodali nitrit ter spremljali koncentracijo glutamina v gojišču. Dokazali so uspešno pretvorbo nitrita v glutamin. Celično kulturo z dodanim nitritom so nanesli na gobico ter jo namestili v regulatorno napravo. Z upadanjem koncentracije nitrita v odvisnosti od časa ter posledično naraščanjem odstotka pretvorbe, so pokazali uspešno pretvorbo nitrita znotraj naprave.

Literatura - Lin, H. Y., Bledsoe, P. J., & Stewart, V. (2007). "Activation of yeaR-yoaG operon transcription by the nitrate-responsive regulator NarL is independent of oxygen-responsive regulator Fnr in Escherichia coli K-12." Journal of bacteriology, 189(21), 7539-7548.