Integracija okoljskih signalov z modularnimi IN vrati
(Dominik Dekleva)
Uvod
Bakterije uporabljajo različne mehanizme za spremljanje okoljskih signalov; dvokomponentne sisteme, transkripcijske faktorje in male RNA. V določenih primerih je okolje definirano z enim signalom, kot je prisotnost ali odsotnost male molekule (operoni lac, trp, fur). V drugih primerih je potrebna integracija več različnih signalov za specifično zaznavanje okolja. Tudi signali, ki so sami po sebi preveč splošni za karekterizacijo okolja (pH, temperatura, osmolarnost) lahko delujejo specifično v kombinaciji. Podoben problem nastane, ko programiramo celice za identifikacijo okolja, ki ni naravno prisotno in nima enega dominantnega signala. V teh primerih so pomembna logična vrata za integracije več signalov in uspešno identifikacijo okolja.
Leta 2007 so prvič v E. coli uspešno vnesli sistem logičnih IN vrat, katerega pomembna lastnost je modularnost. Mikroorganizmi uporabljajo genetska vezja za integracijo okoljskih informacij. V tej študiji so pripravili sintetična IN vrata, ki integrirajo informacijo iz dveh vhodnih promotorjev (vhodni signal) in aktivirajo izhodni promotor (izhodni signal), le ko sta oba vhodna promoterja transkripcijsko aktivna. Integracija poteče preko interakcije med mRNA in tRNA. Sistem je modularen, ker so vhodni in izhodni signali promotorji. S spremembo vhodnih promotorjev lahko sistem vežemo na različne vhodne signale, medtem ko sprememba izhodnega promotorja lahko povzroči drugačen celični odziv.
Modularna IN vrata
In vrata z dvemi vhodnimi signali aktivirajo izhodni signal, le ko sta oba vhodna promotorja aktivna (ON). Idealno je, da je sistem modularen, kar pomeni, da lahko vhodne in izhodne signale z lahkoto zamenjamo. V transkripcijskih sistemih je prikladno, da so povezave med signali promotorji. Izhodni promotor lahko aktivira izražanje gena, ki proizvede določen celični fenotip ali pa deluje kot vhodni promotor v naslednja IN vrata.
V študiji so pripravili tri različne sisteme IN vrat in tako dokazali modularnost.
V prvem primeru so pripravili IN vrata z vhodnimi signali arabinoza in salicilat. Z aktivacijo ustreznih vhodnih promotorjev (Pbad in Psal) pride do aktivacije izhodnega promotorja Pt7 in izražanja proteina GFP. Tako dobimo fluorescenčne celice le ob prisotnosti dveh vhodnih signalov v okolju. Mehanizem IN vrat deluje preko interakcije različnih RNA molekul. Aktiviran Pbad zažene transkripcijo gena za polimerazo T7, ki pa ima dva vmesna amber stop kodona. Taka mRNA je translacijsko neaktivna. Aktivira jo gen supD, ki ga aktivira Psal. SupD je gen za tRNA, ki utiša amber (TAG) stop kodon in ga prekodira v kodon za serin. Na tak način le ob prisotnosti obeh vhodnih signalov v okolju pride do uspešne translacije polimeraze T7, ki aktivira izražanje GFP.
V drugem primeru so inpute zamenjali za dva naravna promoterja (quorum sensing in odzivnost na Mg2+). Pbad in Psal so zamenjali s PmgrB, ki se aktivira ob pomanjkanju Mg2+ in Plux, ki se aktivira ob prisotnosti acilhomoserina, ki je signal za celično gostoto. Pomanjkanje Mg2+ v E. coli zaznava dvokompontentni sistem PhoPQ. Ob znižani zunajcelični koncentraciji iona membranska komponentna PhoPQ fosforilira znotrajcelični regulator PhoPQ, ki aktivira PmgrB. Zaznavanje celične gostote (quorum sensing) je način komunikacije med bakterijami. Ta sistem je zelo pogosto uporabljen v sintetičnih genskih sistemih za programiranje celic, da tvorijo vzorce, regulirajo celično gostoto in ubijejo maligne celice kot odziv velike gostote. Lux promotor in luxR gen, iz V. fischeri, se inducira v odziv na eksogeni acilhomoserinlakton (AHS/AI-1).
V tretjem primeru so kot vhodna promotorja izbrali Psal in PmgrB (salicilat in Mg2+) in zamenjali izhodni signal GFP za Invazin. Tako aktivacija IN vrat omogoča invazijo bakterijskih celic. S tem poskusom so preverili ali lahko output IN vrat kontrolira celično obnašanje (invazivnost). Izražanje gena za invazin iz Y. pseudotuberculosis v E. coli omogoči invazijo sesalskih celic, ki imajo na površju B1-integrinski receptor. Sposobnost invazije so nato testirali, tako da so gojili bakterijske celice skupaj s sesalskimi.
Viri
- iGEM projekt skupine iz Edinburgha: PhagED
- Kutter, E., et. al. Phage Therapy in Clinical Practice: Treatment of Human Infections" Current Pharmaceutical Biotechnology. 2010, 11, 69-86
- Yosef, I., Manor, M., Kiro, R., Qimron, U. Temperate and lytic bacteriophages programmed to sensitize and kill antibiotic-resistant bacteria. PNAS, 2015, 112, 7267-7272
