Reovirusi in drugi dsRNA-virusi

UVOD

Družina reovirusov se deli na dve poddružini (glede na prisotnost/odsotnost proteinskih izrastkov iz notranje kapside), ti pa na več rodov. Najvidnejši rodovi so rotavirusi, orbivirusi in ortoreovirusi. Različni rodovi se med seboj sicer razlikujejo, za modelni rod pa sva si izbrala ortoreoviruse. Glavni predstavnik tega rodu je sicer MRV (sesalčji ortoreovirus). Njegovi gostitelji so vretenčarji, povzroča pa predvsem težave z dihanjem, ljudje so nanj večinoma imuni (brez bolezenskih simptomov).

ZGRADBA

Reovirusi (ortoreovirusi) so veliki približno 850 A°, nimajo ovojnice, sestavljata jih le dve proteinski lupini: notranja kapsida z 10 segmenti genomske dsRNA in zunanja kapsida. Proteini reovirusov so poimenovani glede na velikost genov, ki jih sintetizirajo. Veliki segmenti dsRNA (large, L) vsebujejo zapis za proteine lambda (λ), srednje veliki (medium, M) za proteine mu (μ) ter majhni (small, S) za proteine sigma (σ). Notranja kapsida ima T=1 ikozaedrično simetrijo. Sestavljajo jo dimeri proteina λ1 in monomeri proteina σ2. Pentamerni proteini λ2 oblikujeo kanalčke z gvanililtransferazno in metiltransferazno aktivnostjo, skozi katere RNA molekule izstopajo iz sredice v citosol. Glavni komponenti notranjega sloja sta μ2 in λ3 proteina. Vsaka virusna od RNA odvisna polimeraza λ3 je povezana s tremi monomeri λ1 in je nameščena po ena v vsakem izmed ogljišč ikozaedra notranje kapside. Zunanja kapsida ima ikozaedrično simetrijo T=13. Sestavljena je iz proteinov μ1, ki sodeluje pri vstopu skozi celično membrano in proteinov σ3, ki predstavljajo zaščitno kapo proteinu μ1 (μ13σ33). V vsakem ogljišču zunanje kapside iz notranjosti sega pentamer λ2 na katerem je trimerni protein σ1. σ1 je nekakšen izrastek, ki služi kot pritrditveni protein, s katerim se virus pritrja na gostiteljsko celico in se odcepi med vstopom.

VSTOP V CELICO

Reovirus se na gostiteljsko celico pritrja preko sialične kisline na površini celice. Najprej pride do povezovanja med virusom in sialično kislino, ki imata nizko afiniteto drug do drugega. Virus se tako približa celici, njuna interakcija pa sproži komformacijske spremembe na σ1 podenoti, kar poveča afiniteto do povezovanja z JAM-A (receptor). Interakcija med JAM-A in virusom sproži signalizacijo v celici, čemur sledi receptorsko posredovana endocitoza.

PREHOD SKOZI MEMBRANO ENDOSOMA

V endosomih znotraj celice se zgodi postopen razpad zunanje kapside. Prvi izmed intermediatov, ki nastanejo je ISVP (infectious subviral particle). ISVP nastane z odstranitvijo σ3 proteina, komformacijsko spremembo σ1 in cepitvijo μ1. Do sprememb mora priti, saj celoten virion ni zmožen prehoda skozi lipidno membrano. Protein μ1 se zvija v 4 različne domene. Domene I, II in III so primarne alfa vijačnice, domena IV pa oblikuje jelly-roll β-sodček, ki je pogosto prisoten v proteinih virusov brez ovojnice. μ1 vsebuje tri proteolitska cepitvena mesta, pomembno vlogo ima μ1N in μ1C cepitveno mesto, vloga ostalih dveh pa še ni jasna. Ko pride do cepitve μ1 se namreč sprosti delec μ1N, ki lahko interegira z membrano endosoma. V nativni še necepljeni strukturi μ1 v virionih in ISVPjih je μ1N skrit znotraj hidrofobne votline, ki jo tvorijo domene I, II in III. Domena IV vsebuje anion-vezavno mesto, ki se poveže s fosfolipidnimi glavami v endosomski membrani. To sproži prerazporeditev v μ1, μ1N in notranji hidrofobni ostanki postanejo razkriti zunanjosti. Nastali ISVP* delec nima več σ1 proteina in vsebuje komformacijske spremembe fragmentov μ1, kar daje celotnemu delcu večjo hidrifobnost. μ1 povezan z ISVP je torej metastabilen delec, ki preko komformacijskih sprememb ustvari bolj hidrofobno strukturo, ki lahko interagira z membrano. μ1N v membrani oblikuje poro in ISVP* lahko vstopi v citoplazmo.

GENOM

Ortoreovirusi imajo 10 linearnih dvoverižnih RNA segmentov dolgih med 1000 in 4000 baznih parov, ki jih razdelimo v tri velikostne skupine (L, M in S). Vsak ta segment sestoji iz ne prepisujočih terminalnih delov in pa po večini enega bralnega okvirja za en protein (izjema je bicistronski S1). 5'-konec plus RNA v vsakem segmentu vsebuj dimetilirano Cap 1 strukturo (m7GpppGm2'OH). Genomska RNA tudi nima 3'-končnega poli-A repa ali pa kovalentno vezanih proteinov. Vsebuje pa vseh 10 dsRNA segmentov na obeh koncih evolucijsko konservativna 4 oz. 5 baznih parov dolga 3'/5'-ne prepisujoča končna zaporedja.

TRANSKRIPCIJA

V citosolu se dsRNA znotraj sedaj transkripcijsko aktivne sredice lahko začne prepisovati. V vsakem ogljišču notranje kapside je vgrajen protein λ3, ki je od RNA odvisna RNA polimeraza (RdRp). Vsak λ3 je v interakciji s tremi molekulami proteina, ki oblikuje osredjo kapsido, λ1. λ1 veže dsRNA in deluje kot helikaza. Protein je orientiran tako, da je izhod transkriptov možen preko majhnih kanalčkov v proteinih λ1. RNA nato potuje preko kanala pentamernega encimskega kompleksa λ2. Vsi dsRNA virusi morajo imeti prisotne RdRp molekule znotraj viriona, da prepišejo svoj genom v pozitivno ssRNA, ki se nato uporabi za translacijo in replikacijo med infekcijo. dsRNA v sami gostiteljski celici ni prisotna v nobeni fazi okužbenega cikla. RdRp λ3 ima tri domene s štirimi kanali, ki vodijo do aktivnega mesta. Centralna polimerazna domena ima klasično strukturo dlani (angl. palm, fingers, thumb). Izmed štirih kanalčkov, sta dva pomembna pri vstopu: eden za ssRNA matrico ((-)RNA) in en za NTP molekule. Druga dva kanalčka predstavljata izhodne poti RNA matrice in (+) RNA (mRNA). RNA kapa-vezavno mesto na površini λ3 poleg vstopnega kanala matrice med transkripcijo drži pokrit 5' konec genomske (+)RNA, kar omogoča ponovno združitev s 3' koncem (-)RNA po končani transkripciji. λ3 je orientirana tako, da novo sintetizirana mRNA izstopa skozi kanalček naprej preko λ1 proteina. Kanal λ1 je zaradi stranskih skupin težko prehoden, vendar se med transkripcijo razširi in omogoča prehod mRNA v veliko votlino λ2, kjer nastajajo kape. Specifična encimska aktivnost λ2 je pomembna za mRNA procesiranje med izhodom iz viriona. Pentamer veže GMP in S-adenozil-L-metionin in ima gvanililtransferazno ter metiltransferazno aktivnost. mRNA, ki zapusti delec lahko začne s procesom translacije ali pa predstavlja matrico za sintezo (-)RNA, s katero se združi v dsRNA, v virionskem delcu.

TRANSLACIJA

Poteka v citosolu na podlagi procesirane mRNA matrice. Infekcija z MRV sproži v gostiteljski celici fosforilacijo alfa podenote translacijskega inicijacijskega faktorja (eIF2) s strani PKR (protein kinaza R), kar inhibira gostitelju lastno translacijo (tvorbo kompleksa eIF2/GTP/tRNAiMet), virusna mRNA pa se lahko še naprej prevaja. Ob dotatku zunanjih stresorjev oz. inhibitorjev translacije, ki vodijo do fosforilacije eIF2α s strani specifičnih kinaz, pride do tvorbe SG (stresne granule) v citoplazmi, ki sprejmejo prediniciacijske 43s komplekse (40s -mala podenota ribosoma, mRNA in incijacijski faktorji), ki se s pomočjo T-celičnih antigenov, ki utišajo translacij, povežejo v neaktiven agregat in na ta način zaustavijo vso translacijo, ki ni direktno povezana s stresom. Ko pa stresor popusti, tudi SG razpadejo, translacijski material pa se lahko ponovno uporabi. Ker sta pri ortoreovirusih na S1 segmentu prekrivajoča zapisa (2 ločena ORF) za dva proteina (σ1s in σ1), se koristi mehanizem leaky scanning (značilen za več-genske virusne RNA segmente), kjer se 40s ribosom veže blizu 5'-kape in linearno začne iskati prvi AUG (start) kodon, a ga lahko tudi spregleda in nadaljuje do nekega alternativnega začetka. Na ta način lahko pride do različnih proteinov, ki jih zapisujejo prekrivajoča bralna okna na isti sekvenci. Pri tem obstaja pa tudi preferenca do dotičnih dušikovih baz na mestih tik pred/po start kodonu, s čimer se poviša verjetnosti učinkovitosti tega mehanizma.

PAKIRANJE

Ob razvoju okužbe, se v citoplazmi oblikujejo Virusne tovarne (VF) –membranska struktura ob jedru. Na ta način se na manjšem prostoru skoncentrirajo vse ključne komponente (proteini in nukleinske kisline) za replikacijo in izgradnjo potomke ter se hkkrati prepreči izpostavljenost celičnim obrambnim mehanizmom (odziv na dsRNA preko PKR, ki inhibira celično translacijo ter inducira apoptopske in antivirusne signale). Ključno vlogo ima pri tem nestrukturni protein μNS, če je v celici izražen samostojno, tvori analogne strukture VF, kar kaže na to, da v VF tvori matriks. S svojo vezavo na novo-sintetizirane strukturne proteine osrednje kapside ( μ2, λ1, λ2, λ3in σ2 ) ter RNA-vezaven protein σNS pa tudi regulira razvrščanje virusnih komponent v te razdelke (v njih so torej osrednji virusni deli, virusni proteini in novo sintetizirana mRNA z dsRNA). Ta več vezavna sposobnost μNS omogočajo krajše vezavne regije na N-koncu (izjema: λ3 na C-koncu), μNS tako služi kot ogrodni protein, ki koordinira virusno replikacijo ter združuje posamezne strukturne proteine v nove osrednje virusne dele. Za določitev ključnih signalnih zaporedji, ki določajo pakiranje in razvrstitev samega genoma so koristili MRV +RNA sisteme, kjer so ORF posameznih segmentov zamenjali z reporterjevim genom, ki se izraža namesto deletiranega, ta RNA se prav tako razpakira in replicira kot ostalih 9, le da sintetiziranemu proteinu lahko sledimo. Izkaže se, da se na 5'končni neprevedeni regiji (5'-UTR) nahajajo signali za razvrščanje na treh različnih +RNA. Na podlagi pakiranja pri sorodnih Rotavirusih, kjer evolucijsko ohranjeni 5' in 3' konci tvorijo strukturo panhandle, gre verjeti, da se podobne signalne sekvence in strukture nahajajo na evolucijsko-konservativnih 3'/5'-koncih ortoreovirusne +RNA.

IZHOD IZ CELICE

MRV v gostiteljskih celicah ob nastanku fragmenta φ (iz µ1) aktivira jedrni faktor κB (NF-κB), ti transkripcijski faktorji regulirajo celične odzive na stres, vključno z apoptozo, ki poteče tako prek intrinznične kot tudi ekstrinznične signalne poti. Do celične apoptoze torej pride zaradi virusnega razpada ne pa zaradi same transkripcije. MRV v transformiranih celicah teži k litični replikaciji in izhodu iz celice, kar regulirata pot RAS in PKR aktivnost.

VIRI

1. Zhang X, Walker SB, Chipman PR, Nibert ML, Baker TS. Reovirus polymerase λ3 localized by cryo-electron microscopy of virions at a resolution of 7.6 Å. Nature structural biology. 2003;10(12):1011-1018. doi:10.1038/nsb1009
2. Danthi P, Guglielmi KM, Kirchner E, Mainou B, Stehle T, Dermody TS. From Touchdown to Transcription: The Reovirus Cell Entry Pathway. Current topics in microbiology and immunology. 2010;343:91-119. doi:10.1007/82_2010_32