Mišji modeli kratkovidnosti: drugačnopomenska točkovna mutacija (S673G) in skrajševalna mutacija v Zfp644 posnemata fenotip človeške bolezni

Kratkovidnost je najpogostejša motnja vida, ki lahko nastane zaradi predolgega očesnega zrkla ali prevelike lomne moči očesa. Prizadeto oko ne more izostriti slike oddaljenih predmetov, saj se lomljeni žarki zberejo pred mrežnico<ref name="prvi">I. G. Morgan, K. Ohno-Matsui, S. M. Saw: Myopia. Lancet. 2012, 379, 1739-48. </ref>. Trenutni živalski genetski modeli kratkovidnosti slabo posnemajo človeško bolezen. Raziskovalci so v članku opisali pripravo in karakterizacijo dveh mišjih modelov kratkovidnosti, na podlagi mutiranega proteina s cinkovimi prsti 644<ref name="drugi">K. I. Szczerkowska, S. Petrezselyova, J. Lindovsky, M. Palkova, J. Dvorak, P. Makovicky, M. Fang, C. Jiang, L. Chen, M. Shi, X. Liu, J. Zhang, A. Kubik-Zahorodna, B. Schuster, I. M. Beck, V. Novosadova, J. Prochazka, R. Sedlacek: Myopia disease mouse models: a missense point mutation (S673G) and a protein-truncating mutation of the Zfp644 mimic human disease phenotype. Cell Biosci. 2019, 9, 21. doi:10.1186/s13578-019-0280-4. </ref>.

Protein s cinkovimi prsti 644

Protein s cinkovimi prsti 644 (ZNF644) je človeški protein, ki interagira z evkromatinsko histonsko metiltransferazo G9a. ZNF644 naj bi usmerjal in reguliral funkcijo metilacijskega kompleksa G9a/GLP ter tako sodeloval pri utišanju specifičnih genov<ref name="tretji">C. Bian, Q. Chen, X. Yu: The zinc finger proteins ZNF644 and WIZ regulate the G9a/GLP complex for gene repression. Elife. 2015, 19, 4. </ref>. Kitajski raziskovalci so mutacije v genu ZNF644 povezali z nastankom hude oblike dominantne dedne kratkovidnosti<ref name="cetrti">Y. Shi, Y. Li, D. Zhang, H. Zhang, Y. Li, F. Lu, X. Liu, F. He, B. Gong, L. Cai, R. Li, S. Liao, S. Ma, H. Lin, J. Cheng, H. Zheng, Y. Shan, B. Chen, J. Hu, X. Jin, P. Zhao, Y. Chen, Y. Zhang, Y. Lin, X. Li, Y. Fan, H. Yang, J. Wang, Z. Yang: Exome sequencing identifies ZNF644 mutations in high myopia. PLos Genet. 2011, 7, e1002084. </ref>.

Vzorec izražanja Zfp644

Mišji protein Zfp644 je homolog človeškega proteina ZNF644, na osnovi katerega so želeli raziskovalci pripraviti mišji genetski model kratkovidnosti. Z in situ hibridizacijo na celotnem mišjem embriju so ugotovili, da se Zfp644 med embrionalnim razvojem izraža v očeh, možganih in vratnem delu živčnega sistema. Na tkivnih preparatih oči odraslih živali so opazili, da se gen Zfp644 primarno izraža v mrežnici in leči<ref name="drugi"/>. Glede na lokacijo izražanja in genetsko ozadje, je bil Zfp644 dober kandidat za pripravo modela.

Priprava modelov

Aminokislinska zamenjava S672G v ZNF644 je ena od znanih mutacij, ki pri človeku vodijo v nastanek hude oblike dedne kratkovidnosti. Aminokislinsko zaporedje mišjega Zfp644 je zelo ohranjeno glede na človeški homolog, zato so kot kandidatno ekvivalentno mutacijo želeli pripraviti mutacijo S673G v mišjem Zfp644. Uporabili so metodo urejanja genoma s TALEN-i, za katero so načrtali specifični zaporedji ponovitev DNA-vezavnih domen TAL efektorjev, ki prepoznata zaporedje DNA levo in desno ob tarčni regiji. S tehniko kloniranja Golden Gate so v dveh ločenih plazmidih sestavili zapisa DNA za levi in desni TALEN ter z in vitro transkripcijo in poliadenilacijo pridobili njuno mRNA. mRNA so zmešali s sintetičnimi oligonukletidi, ki so vsebovali želeno točkovno mutacijo gena Zfp644, ter mešanico mikroinjicirali v moško projedro mišjih zigot. Iz teh so vzgojili odrasle miške in ugotovili, da so pridobili dve različni liniji transgenih živali. Prva linija je nosila želeno mutacijo S673G v genu Zfp644 (linija Zfp644^S673G), pri drugi liniji pa je prišlo do delecije 8 nukleotidov (linija Zfp644^Δ8) in zamika bralnega okvirja, kar je privedlo do zgodnjega STOP kodona. Posledično se pri miškah Zfp644^Δ8 sintetizira skrajšana oblika proteina<ref name="drugi"/>.

Karakterizacija modelov

Mutantne linije so oftalmološko okarakterizirali, da bi ugotovili, če se pri miškah izrazi fenotip človeške bolezni. Z ultrazvočnim pregledom zrkla so preučili notranje strukture očesa ter izmerili ključne očesne parametre. Pri miškah Zfp644^S673G je prišlo do izrazitega povečanja aksialne dolžine zrkla samo pri samcih, penetranca fenotipa pa je bila večja pri heterozigotnih živalih. Pri obeh spolih so opazili povečanje premera očesne leče, ki je bilo bolj izrazito pri heterozigotih. Penetranca fenotipa pri heterozigotih nakazuje na dominantno negativno obnašanje mutiranega alela, kar se ujema z dedovanjem pri človeških pacientih<ref name="cetrti"/>. Pri miškah Zfp644^Δ8 so se spolno in alelno neodvisno spremenili vsi pomembni očesni parametri - aksialna dolžina, globina votline s steklovino in debelina leče<ref name="drugi"/>. Vsaka od sprememb doprinese k poslabšanju vida, zato imajo miške linije Zfp644^Δ8 hujšo obliko kratkovidnosti, ki se sklada s človeškim fenotipom<ref name="cetrti"/>.

Pri obeh modelih so preverili še morfologijo in funkcionalnost mrežnice, ki se pri človeški bolezni vsaj na začetku ne spremenita. Oči homozigotov so preučili z optično koherenčno tomografijo, ki omogoča analizo očesnega ozadja z visoko ločljivostjo. Položaj slepe pege, morfologija plasti mrežnice in vzorci očesnih žil pri modelnih živalih niso odstopali od parametrov mišk divjega tipa. Za zaključek so z elektroretinografijo preverili še funkcionalnost mrežnice pri odzivu na svetlobne dražljaje. Analiza ponovno ni pokazala abnormalnosti pri transgenih živalih<ref name="drugi"/>. Novi mišji liniji se torej s človeško boleznijo ujemata tudi v ohranjeni morfologiji očesnih struktur in funkcionalnosti mrežnice.

Zaključek

Raziskovalci so razvili dva mišja modela, ki dobro posnemata dedno človeško kratkovidnost. Fenotip je bil bolj izrazit pri miškah s skrajšano obliko proteina (Zfp644^Δ8), pri obeh modelih pa sta se ohranili funkcija in morfologija mrežnice. Modela sta precej boljša od obstoječih živalskih modelov kratkovidnosti in bosta omogočila preučevanje molekularne vloge ZNF644 pri ljudeh z dedno obliko bolezni. Modela bi lahko uporabili tudi za testiranje potencialnih terapij za to bolezen.

Viri in literatura

<references/>