Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka

Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.

Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA

Uvod - hipertenzija

Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.

Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.

Cilj članov ekipe je bil razvoj antihipertenzivnega probiotičnega zdravila.

Dizajn antihipertenzivnih peptidov

Zasnovali so 10 visoko aktivnih hipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur. Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo in vitro aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.

Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP-jev: dva izmed njih sta novo dizajnirana peptida KYLCY in FKGKYYP, ostale tri VY, IPP in VPP pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.

Regulacija izražanja AHP-jev

Za regulacijo izražanja rekombinantnega proteina AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducirani promotor rcfB, represor LacR ter operatorje O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:

(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducirani promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži ekspresijo represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorska gena O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.

Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.

(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, pH-inducirani promotor rcfB ne sproži ekspresije represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorska gena O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.

S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.

Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi in vivo. Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg).

Samomorilni mehanizem

Da so zagotovili neškodljivost transgenskih bakterij za okolje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem, ki za delovanje uporablja naslednji princip: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To sproži promotor T-αcrp, da prekomerno izrazi gen za avtolitični encim N-acetilamuramidazo (acmA).

V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.

Biokocke

Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:

(I) biokocke za pH senzorje: promotor PrcfB (Ba_K3142000), laktozni operator O1/O2 (BBa_K3142001), Lac represor LacR (BBa_K3142015) in sestavljena biokocka PrcfB + LacR (BBa_K3142002),

(II) biokocke za ekspresijo AHP: argininski linker FR (Ba_K3142003), 11S globulin iz amaranta A11Sg (Ba_K3142004), antihipertenzivni peptidi VY (Ba_K3142005), IPP (Ba_K3142006), VPP (Ba_K3142007), KYLCY (Ba_K3142008) in FKGKYYP (Ba_K3142009), sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM (Ba_K3142010) ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM (Ba_K3142011) in

(III) biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij: promotor PT-αCRP (Ba_K3142012), N-acetilmuramidaza acmA (Ba_K3142013) in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA (Ba_K3142014).