Antihipertenzivni probiotik - nov pristop zniževanja krvnega tlaka
Antihipertenzivni probiotik kot nov pristop zniževanja krvnega tlaka je projekt študentske ekipe Shenzhen Polytechnic (SZPT) iz Kitajske, s katerim so leta 2019 nastopili na tekmovanju iGEM. Cilj ekipe je bil razvoj probiotičnega zdravila, ki bi se uporabljalo za zdravljenje hipertenzije.
Spletna stran projekta: https://2019.igem.org/Team:SZPT-CHINA
Uvod
Hipertenzija ali visok krvni tlak je pogosta kronična bolezen žil, pri kateri simptomi navadno niso izraženi, vseeno pa vpliva na povišano tveganje za nastanek srčnožilnih bolezni (srčnega infarkta, možganske kapi idr.). Po podatkih Svetovne zdravstvene organizacije zaradi zapletov hipertenzije vsako leto umre približno 9,4 milijonov ljudi po vsem svetu. Zdravljenje je zato nujno potrebno.
Pri regulaciji krvnega tlaka je pomemben sistem renin – angiotenzin – aldosteron. Osrednji encim, povezan s hipertenzijo, je angiotenzin konvertaza (ACE), ki katalizira pretvorbo angiotenzina I (AngI) v angiotenzin II (AngII). Slednji je močan vazokonstriktor, zato ima velik učinek na zviševanje krvnega tlaka. Za zdravljenje hipertenzije se tako pogosto uporabljajo inhibitorji ACE.
Člani ekipe so si zastavili cilj, da razvijejo antihipertenzivno probiotično živilo.
Oblikovanje antihipertenzivnih peptidov
Zasnovali so 10 visoko aktivnih antihipertenzivnih peptidov (AHP) z uporabo tehnologije prstnega odtisa na osnovi proteinskih struktur (ang. protein structure fingerprinting technology). Gre za metodo, ki pomaga preučevati konformacijo proteinov. AHP so nato sintetizirali in analizirali njihovo in vitro aktivnost. Ta je bila ovrednotena s parametrom IC50; čim manjšo vrednost ima parameter, tem večja je aktivnost zniževanja krvnega tlaka.
Skupno so za izbrali 5 visoko aktivnih AHP: izmed njih so dva peptida na novo zasnovali sami (KYLCY in FKGKYYP), ostale tri (VY, IPP in VPP) pa so izbrali na podlagi obstoječe baze podatkov o antihipertenzivnih peptidih. Aktivne peptide AHP so z argininskimi linkerji (FR) v več ponovitvah povezali v neaktivne multimere (AHPM), dolge 78 aminokislin. Te linkerje so izbrali zato, ker predstavljajo cepitveno mesto prebavnih encimov, po hidrolizi pa tako nastane veliko število hipotenzivnih peptidov.
Aminokislinsko zaporedje AHPM:
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR
FKGKYYP FR VY IPP FR KYLCY VPP FR
Regulacija izražanja AHP
Člani ekipe so razvili idejo, da za biološko šasijo uporabijo probiotično živilo. Uporabnik probiotike zaužije, bakterije pa se nato kolonizirajo v črevesju, kjer začnejo izražati AHPM. Za regulacijo izražanja AHPM v gostiteljski celici so uporabili pH-inducibilni promotor rcfB, represor LacR ter operatorja O1 in O2, ki delujejo po sledečem principu:
(1) Ko se zunajcelični pH zmanjša pod vrednost 5,5, pH-inducibilni promotor rcfB zazna spremembo kislosti in sproži izražanje represorja LacR. Slednji se nato veže na operatorski regiji O1 in O2, kar zavre izražanje gena za AHPM.
Tako so preprečili, da bi se AHPM po zaužitju razgradil že v želodcu.
(2) Ko se zunajcelični pH dvigne nad vrednost 5,5, ne pride do izražanja represorja LacR. Represor LacR se razgradi in sprosti operatorski regiji O1 in O2, gen za AHPM pa se začne izražati.
S tem so omogočili, da začne gostiteljska celica izražati gen za AHPM šele v črevesju. Tam prebavna encima tripsin in kimotripsin hidrolizirata AHPM v aktivne monomere AHP. Aktivnost ACE je torej inhibirana, saj lahko AHP vstopajo v krvni obtok preko črevesne sluznice. V tem primeru AngI ni spremenjen v AngII, krvni tlak ni povišan in cilj je dosežen.
Kljub temu, da so antihipertenzivne peptide povezali v multimer, je njihova molekulska masa še vedno le okoli 10 kDa, kar bi predstavljalo težavo pri biosintezi in vivo. Zato so se odločili, da uporabijo dve strategiji fuzijske ekspresije, za kar so uporabili dve različni fuzijski oznaki: glutation transferazo (GST) in globulin iz semen amaranta (A11Sg) - izkazalo se je, da ta daje boljše rezultate.
Izražanje A11SG-AHPM v mlečnokislinskih bakterijah
Gen za A11Sg-AHPM so vstavili v ekspresijski vektor pET-28a(+). Rekombinantne plazmide pET-28a(+)-A11Sg-AHPM so nato vnesli v E. Coli in uspešno transformirane bakterije selekcionirali na ploščah, ki so vsebovale 50 μg/mL kanamicina. Celice so nato inducirali z IPTG in izvedli SDS-PAGE ter prenos western. Fuzijski protein A11Sg-AHPM so očistili z afinitetno kromatografijo. Zmes A11Sg in AHP peptidov so pridobili s hidrolizo s tripsinom.
A11Sg-AHPM so nato vstavili v ekspresijski vektor pMG36e za izražanje v mlečnokislinskih bakterijah. Da bi omogočili izločanje fuzijskega proteina v črevesje, so ga povezali še s sekretornim signalnim peptidom SPusp45. Poleg tega so za uporabo s pH uravnanega promotorja, ki regulira izražanje A11Sg-AHPM, vstavili tudi operater O1/O2. Uspešnost konstrukcije rekombinantnega ekspresijskega vektorja so potrdili z restrikcijsko analizo in PCR.
Pripravljen vektor so z elektroporacijo vstavili v bakterijo Lactococcus Lactis. Ta predstavlja dober gostiteljski sistem brez potenciala za infekcijo in patogenost. Bakterije so nato gojili na gojišču GM17. Fermentacijsko brozgo so analizirali z SDS-PAGE. Uspešnost izločanja SPusp45 so dokazali s proteinsko elektroforezo.
Za določevanje in vitro aktivnosti fermentacijskega supernatanta mlečnokislinski bakterij so supernatant hidrolizirali s tripsinom in α-kimotripsinom. Fuzijskega proteina A11Sg-AHPM ni bilo mogoče očistiti, zato so po fermentaciji supernatant neposredno hidrolizirali in analizirali aktivnost. Iz primerjave vrednosti IC50 s kontrolnim supernatantom je razvidno, da ima fermentacijski supernatant MG1363 z vstavljenim vektorjem pMG36e-A11Sg-AHPM veliko višjo inhibitorno aktivnost kot kontrolni vzorec. Iz tega je razvidno, da se fuzijski protein z antihipertenzivnim peptidom lahko izloča zunaj celice in po encimski hidrolizi kaže antihipertenzivni učinek.
Da so preprečili razgradnjo AHPM v prenizkem pH (že v želodcu), so v mlečnokislinsko bakterijo MG1363 vstavili gen PrcfB-LacR. Po tem, ko so konstruirali sistem za regulacijo glede na vrednost pH okolja, so rekombinantne bakterije gojili v gojiščih z različnimi vrednostmi pH. Z eksperimenti so pokazali, da pri pH < 5,5 skoraj ne pride do izražanja gena za A11Sg-AHPM, do izražanja pride le pri pH > 5,5; iz tega so sklepali na uspešnost regulatornega mehanizma.
Izražanje gena NisI v L. Lactis MG1363
Ker je potrebno delovanje biološke šasije dokončno oceniti v črevesju, so potrebovali ekspresijski vektor, varen za zaužitje. Gen za odpornost proti eritromicinu originalnega plazmida pMG36e so zamenjali z genom za odpornost proti nisinu nisI in rekombinantni vektor poimenovali pMG36N.
Vektor so vnesli v mlečnokislinske bakterije MG1363 in jih nanesli ploščo z nisinom in eritromicinom. Rekombinantni sev je zrasel na plošči z nisonom, ne pa tudi na tisti z eritromicinom, s čimer so pokazali, da je bila zamenjava gena za odpornost uspešna.
Mlečnokislinske bakterije MG1363, ter MG1363 z vektorjem pMG36e in pa MG1363 z vektorjem pMG36N so bile inokulirane v medije GM17 z od 0 do 100 s korakom po 10 enot/ml nisina. Po 12 urah so odvzeli vzorce in izvedli meritve optične gostote pri 600 nm ter primerjali njihovo rast. Ugotovili so, da je rast pri MG1363 ter pri MG1363 z vektorjem pMG36e v gojišču GM17 z nisinom močno inhibirana. Nasprotno pa so pri bakterijah MG1363 z vektorjem pMG36N tudi v prisotnosti visokih koncentracij nisina še vedno opazili zelo dobro rast. To je pokazalo, da se gen nisI, ki zapisuje lipoprotein nisin, v MG1363 izraža in temu sevu omogoča odpornost proti nisinu. Vseeno pa se pri povečevanju koncentracije nisina tudi rast tega seva zmanjšuje.
Samomorilni mehanizem
Ker uporaba transgenskih bakterij v prehrambeni industriji, kjer je mogoče, da pride do nekontroliranega sproščanja genskega materiala v okolje, predstavlja tveganje, so oblikovali poseben varnostni sistem - samomorilni mehanizem. Za delovanje so uporabili encim N-acetilamuramidazo (acmA), ki je glavni avtolizin bakterije L. Lactis. Zamislili so si naslednji mehanizem: ko se probiotiki izločajo z blatom, v okolju začne primanjkovati glukoze. To omogoči izražanje gena acmA, ki je pod kontrolo inducibilnega promotorja T-αcrp.
V eksperimentu so transgenske bakterije izpostavili različnim koncentracijam glukoze. Z rezultati so pokazali, da je pri manj kot 0,05 % koncentraciji glukoze v okolju rast bakterij znatno inhibirana.
Biokocke
Za namen projekta so uporabili 16 biokock, ki jih lahko razdelimo v 3 kategorije:
(I) biokocke za pH senzorje: promotor PrcfB (Ba_K3142000), laktozni operator O1/O2 (BBa_K3142001), Lac represor LacR (BBa_K3142015) in sestavljena biokocka PrcfB + LacR (BBa_K3142002),
(II) biokocke za ekspresijo AHP: argininski linker FR (Ba_K3142003), 11S globulin iz amaranta A11Sg (Ba_K3142004), antihipertenzivni peptidi VY (Ba_K3142005), IPP (Ba_K3142006), VPP (Ba_K3142007), KYLCY (Ba_K3142008) in FKGKYYP (Ba_K3142009), sestavljena biokocka za antihipertenzivni peptidni multimer AHPM (Ba_K3142010) ter sestavljena biokocka A11Sg-AHPM (Ba_K3142011) in
(III) biokocke, povezane z avtolizo mlečnokislinskih bakterij: promotor PT-αCRP (Ba_K3142012), N-acetilmuramidaza acmA (Ba_K3142013) in sestavljena biokocka PT-αCRP + acmA (Ba_K3142014).
Zaključek
Člani ekipe so s projektom pokazali, da je zamišljen regulatorni mehanizem aplikativno naravnan in kaže potencial za nadaljnji razvoj. Kljub oceni in vitro aktivnosti pa bi bilo potrebno raziskati hipotenzivni učinek AHP na živalskih modelih in oceniti število živih bakterij znotraj roka uporabnosti izbranega fermentiranega živila, najboljše pogoje za skladiščene ter biološko razpoložljivost. V nadaljevanju načrtujejo tudi oceno učinkovitosti v človeškem telesu in posvečanje posebne pozornosti dejavnikom tveganja.
