Priprava sistema s proteinskimi logičnimi vrati na površini lipidnih membran
Večina sinteznobioloških logičnih vrat deluje na nivoju DNA, kjer prisotnost oziroma odsotnost vhodnega signala vpliva na izražanje nekega gena. V primeru proteinskih logičnih vrat pa vhodni signal vpliva na spremembo v delovanju proteina (npr. aktivacija encima ali transporterja, odprtje kanalčka, itd.). Pri tem lahko ista proteinska domena opravlja tako vlogo sprejemanja signala kot efektorsko funkcijo, lahko pa ti vlogi opravljata različni domeni znotraj večdomenskega proteina ali celo različni proteini v večproteinskem kompleksu. Taki sistemi so bili razviti predvsem v raztopinah z uporabo topnih proteinov, medtem ko možnost uporabe transmembranskih proteinov v ta namen še ni bila zares preučena in izkoriščena, kar je posledica predvsem številnih težav in ovir, na katere naletimo pri delu z membranskimi sistemi [1].
Tega izziva se je lotila skupina iz Kemijskega inštituta, ki je zasnovala proteinska logična vrata, ki delujejo na lipidni membrani, pri čemer sistem funkcionira tako, da ustrezna kombinacija zunanjih signalov (nizek pH, reduktivno okolje, prisotnost metaloproteaz) povzroči nastanek pore v membrani. Logična vrata so sestavljena iz dvoproteinskega sistema, ki vsebuje mutirano varianto listeriolizina O, ki je zmožen tvoriti membransko poro, in specifičnega DARPina, ki nastanek te pore inhibira [2].
Sestavni deli sistema
Mutirana oblika listeriolizina O (Y406A)
Listeriolizin O je glavni virulentni dejavnik Listerie monocytogenes, ki tvori pore v membrani in bakteriji omogoča pobeg iz fagolizosoma v citoplazmo okužene celice [3]. Skupaj s sorodnimi proteini drugih gram pozitivnih bakterij ga uvrščamo v skupino od holesterola odvisnih citolizinov, ki tvorijo pore v membranah bogatih s holesterolom [4]. Listeriolizin O se sintetizira kot topen monomerni protein, ki po pritrditvi na membrano preko holesterol-vezavne regije oligomerizira, tako da pride do nastanka obroča sestavljenega iz 30–50 podenot, ki pa v tej stopnji še ne tvori pore. Nastanek proteinskega kompleksa na površini membrane povzroči konformacijske spremembe znotraj posameznih podenot, pri čemer dva para α-vijačnic preideta v amfipatični β-lasnici, ki se zasidrata v membrano in jo prečkata. β-lasnice posameznih podenot skupaj tvorijo β-sodček, ki deluje kot pora s premerom okoli 20 nm, kar omogoča prehajanje snovi tudi z večjo molsko maso [3,4].
DARPin D22 (za Y406A specifičen DARPin)
Proteini z dizajniranimi ankirinskimi ponovitvami (DARPini) so z genetskim inženiringom pridobljeni proteini, ki podobno kot protitelesa izkazujejo visoko afiniteto in specifičnost do vezave tarčnega antigena, proti kateremu so bili razviti. S poravnavo številnih naravno prisotnih ankirinskih ponovitev, je bilo določeno kateri aminokislinski ostanki imajo ključno strukturno vlogo, medtem ko lahko ostale ostanke poljubno spreminjamo, kar je omogočilo izdelavo ogromne knjižnice z različnimi variantami teh ponovitev. S kombiniranjem teh variant dobimo DARPine, ki so po navadi zgrajeni iz 4 ali 5 ponovitev, njihova molekulska masa pa znaša 14 oz. 18 kDa. S procesom selekcije lahko iz celotne knjižnice izberemo varianto, ki se močno in specifično veže na želeno tarčo [7].
Raziskovalna skupina je želela v svoj sistem vnesti proteinsko komponento, ki bi inhibirala nastanek pore, zato so v ta namen pripravili za Y406A specifičen DARPin. Primerno varianto DARPina so izbrali iz obsežne knjižnice preko predstavitve na ribosomu. Po več zaporednih procesih izpiranja so za nadaljnjo delo izbrali varianto DARPina, ki so ga poimenovali D22. Ta je bil primeren, saj se je z veliko afiniteto vezal na Y406A (ne pa na nativni listeriolizin O), hkrati pa ni onemogočal njegove vezave na membrano. Da bi ugotovili, ali lahko DARPin D22 prepreči nastanek por, so izvedli test permeabilizacije veziklov in hemolize, kjer je bilo v obeh primerih ugotovljeno, da v prisotnosti DARPina D22 Y406A ne tvori por kljub znižanemu pH [2].
Ker je bil cilj raziskave razvoj sistema, ki bi deloval na površini lipidne membrane, DARPin D22 pa se sam po sebi ne veže nanjo, so na C-končni del proteina dodali še polipeptid, ki bi omogočal pripenjanje na membrano, hkrati pa bi imel regulatorno vlogo pri samem delovanju sistema. Polipeptid je sestavljen iz zaporedja GPLGMLSQ, ki je prepoznavno cepitveno mesto za metaloproteazo matriksa 9 (MMP9), sledi mu vmesnik GGGSGGGS, zaključi pa se s C-končnim cisteinskim ostankom, ki lahko z lipidi, ki vsebujejo primerno funkcionalno skupino, tvori tioetrsko ali disulfidno vez in tako pritrdi DARPin na površino membrane [2].
Fosfolipidni vezikel
Poleg proteinskih komponent, je ključen del sistema tudi lipidna membrana, ki funkcionira kot platforma, na kateri se sinteznobiološka logična vrata izvajajo. V raziskavi so v ta namen pripravili unilamelarne vezikle različnih velikosti. Uporabljena mešanica lipidov je morala poleg tvorbe veziklov omogočati tudi vezavo obeh proteinskih komponent sistema. Poleg POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoholin), ki je klasična komponenta pri pripravi veziklov, so vezikli vsebovali še holesterol, ki je omogočal nekovalentno pritrditev Y406A, ter bodisi DSPE-PEG2000Mal (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[maleimid (polietilen glikol)-2000]) ali DSPE-PEG2000PDP (1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N-[3-(2-piridyil)-ditiopropionil (polietilen glikol)-2000]), ki omogočata kovalentno pripenjanje DARPina D22 preko C-končnega cisteinskega ostanka (molsko razmerje posameznih komponent je bilo 60:38:2). Pri pripenjanju DARPina nastane v primeru DSPE-PEG2000Mal ireverzibilna tioetrska vez, v primeru DSPE-PEG2000PDP pa reverzibilna disulfidna vez, ki jo je mogoče prekiniti z dodatkom reducenta, s čimer lahko DARPin D22 odstranimo s površine membrane [2].
