Sistem za brezcelično sintezno biologijo na osnovi ''E. coli''
Pri sintezni biologiji na osnovi brezceličnih sistemov gre za sintezo različnih bioloških molekul v raztopini oziroma v okolju, ki ni celica<ref> Swartz, J. Developing cell-free biology for industrial applications. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33, 476–485 (2006).</ref>. V zadnjih letih uporaba brezceličnih sistemov postaja čedalje bolj priljubljena, saj v takšnih sistemih različna genetska vezja lahko zgradimo in testiramo bistveno hitreje kot v celicah, hkrati pa je v njih mogoč natančen nadzor nad koncentracijo molekul<ref>Noireaux, V., Bar-Ziv, R. & Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 12672–12677 (2003).</ref>,<ref name ="vir 3"> Caschera, F. & Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162–168 (2014).</ref> in reakcijskimi pogoji<ref>Khambhati, K. et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Front. Bioeng. Biotechnol. 7, 1–16 (2019).</ref>. Brezcelični sistemi nam omogočajo pripravo proteinov, ki jih v celicah zaradi citotoksičnosti ne moremo pripraviti<ref>Salehi, A. S. M. et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnol. J. 11, 274–281 (2016).</ref>.
V preteklosti so znanstveniki za brezcelično izražanje proteinov večinoma uporabljali hibridne sisteme, v katerih transkripcija poteka na osnovi komponent iz bakteriofagov, translacija pa na osnovi molekul iz E.coli<ref>Nevin, D. E. & Pratt, J. M. A coupled in vitro transcription-translation system for the exclusive synthesis of polypeptides expressed from the T7 promoter. FEBS Lett. 291, 259–263 (1991).</ref>. Slabost takšnih sistemov je pomanjkanje raznolikosti regulatornih elementov, kar onemogoča sestavo kompleksnih vezij. Raziskovalna skupina prof. dr. Noireauxa je zato razvila prvi sistem za brezcelično izražanje proteinov, ki je v celoti zasnovan na osnovi E.coli. Do leta 2016 so sistem izboljšali v tolikšni meri, da je danes komercialno dostopen kot komplet reagentov z imenom myTXTL (Arbor Biosciences). Sistem so podrobno opisali in okarakterizirali v članku, objavljenem v reviji ACS Synthetic Biology<ref name="vir 7">Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M. & Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth. Biol. 5, 344–355 (2016).</ref>.
Opis sistema
Sistem temelji na približno 20-krat razredčenem citoplazemskem ekstraktu E.coli (sev BL21 Rosetta2), ki predstavlja 1/3 volumna osnovne zmesi za brezcelično izražanje proteinov. Preostanek osnovne zmesi sestavljajo pufer PGA (sestava je prikazana v tabeli 1), aminokisline (koncentracija vsake je 3 mg/ml), magnezijev glutamat (5 mM), kalijev glutamat (60 mM) in maltoza (15 mM). Izražanje proteinov v bezceličnem sistemu poteka tako, da osnovni zmesi, ki predstavlja 3/4 končnega volumna reakcije, dodamo izbrani(/-e) plazmid(e) in vodo. Če protein(e) želimo izraziti iz linearne DNA, moramo v reakcijsko zmes dodati še protein gamS. Slednji preprečuje razgradnjo DNA z endonukleazo RecBCD, ki se endogeno izraža v E.coli in je zato prisotna tudi v ekstraktu. Reakcijsko zmes inkubiramo pri 29-30 ᵒC, čas inkubacije pa je odvisen od reakcije<ref name=" vir 7" />.
| reagent | količina |
|---|---|
| Hepes | 50 mM , pH 8 |
| ATP, GTP | 1,5 mM |
| CTP, UTP | 0,9 mM |
| tRNA | 0,2 mg/ml |
| koencim A | 0,26 mM |
| NAD | 0,33 mM |
| cAMP | 0,75 mM |
| folinska kislina | 0,068 mM |
| spermidin | 1 mM |
| 3-fosfoglicerat | 30 mM |
| ditiotreitol (DTT) | 1 mM |
| polietilenglikol 8000 (PEG800) | 2 % |
| IPTG | 1 mM |
Preko izražanja skrajšane in optimizirane različice izboljšanega zelenega fluorescirajočega proteina (deGFP) so znanstveniki dokazali, da se proteini tako iz linearizirane kot iz plazmidne DNA izražajo od 8 do 10 ur, pri čemer koncentracija proteina linearno narašča prvih 4 do 5 ur, nato pa se ustali. Z izražanjem iz plazmidne DNA dobimo več kot 2 mg/ml reporterskega proteina, izplen pri izražanju iz linarne DNA pa je nekoliko nižji. Izplen lahko povečamo, če namesto šaržnega uporabimo semikontinuirni sistem. V tem primeru iz plazmidne DNA lahko dobimo do 6 mg/ml deGFP<ref name="vir 7" />.
Za optimalno izražanje proteinov v brezceličnem sistemu so ključni štirje procesi: transkripcija, translacija, razgradnja mRNA in razgradnja proteinov<ref name="vir 7" />.
Transkripcija
Transkripcijo so Noireaux in sodelavci najprej zasnovali na osnovi holoencima osrednje RNA polimeraze in faktorja σ70 <ref> Shin, J. & Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4, 2–10 (2010)</ref>, ki ga je tudi v razredčenem citoplazemskem ekstraktu dovolj, da omogoči začetek transkripcije. Kasneje so regulatorni nabor razširili še na druge faktorje σ iz E.coli (σ19, σ24, σ28, σ32, σ38, σ54), ki jih je zaradi razredčenosti citoplazemskega ekstrakta v osnovni zmesi za brezcelično izražanje premalo, da bi omogočali transkripcijo. V sistem za brezcelično izražanje jih zato vnesemo preko vnosa plazmidov z DNA zapisom zanje. Uporabimo lahko že pripravljene plazmide iz seta plazmidov pTXTL, ki so jih znanstveniki pripravili kot dodatek kompletu reagentov myTXTL. Set sestavlja več kot 100 plazmidov, ki zapisujejo za faktorje σ in različne reporterske proteine. Da bi uporabnikom olajšali sestavljanje vezij, so faktorje σ in pripadajoče promotorje okarakterizirali po moči (70>28>32>38>19>24) in specifičnosti (32>54>28>70≈38≈24>19)<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />.
Translacija
Translacija poteka s pomočjo komponent citoplazemskega ekstrakta iz E.coli, komponent pufra PGA in aminokislin. Translacija je energijsko precej potraten proces, saj so za podaljšanje nastajajoče polipeptidne verige za 1 aminokislino potrebne 4 molekule ATP<ref name="vir 7" />. Ob hidrolizi vsake molekule ATP se sprosti fosfat, ki veže magnezijeve ione v reakcijski mešanici, kar inhibira transkripcijo in translacijo. Raziskovalci so zato v sistem za brezcelično izražanje implementirali sistem, ki temelji na pretvorbi maltoze v laktat in acetat in neto regenerira eno molekulo ATP na en porabljen fosfat, s čimer so bistveno povečali učinkovitost izražanja proteinov<ref name="vir 3" />,<ref name="vir 7" />,<ref>Wang, Y. & Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnol. 9, 1–8 (2009).</ref>.
Razgradnja mRNA
Sistem za razgradnjo mRNA nam omogoča nadzor nad količino (vmesnih) produktov. Bakterije E.coli izražajo toksin MazF, ki prepoznava zaporedja ACA na mRNA in mRNA najpogosteje cepi na 5'-koncu teh zaporedij. Pri fiziološki pogojih razgradnja mRNA s toksinom MazF večinoma ne poteka, saj sta izražanje in aktivnost toksina MazF regulirana z antitoksinom MazE<ref> Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 779–790 (2011).</ref>. Razgradnjo mRNA v brezceličnem sistemu lahko povzročimo s prekomernim izražanjem ali dodatkom toksina MazF v reakcijsko mešanico. Z dodatkom različnih količin toksina MazF so znanstveniki življenjsko dobo mRNA, iz katere se prevede deGFP, v brezceličnem sistemu uspeli znižati za do približno 6-krat<ref name="vir 7" />.
Razgradnja proteinov
Količino (vmesnih) produktov je preko razgradnje s proteolitičnim kompleksom ClpXP mogoče regulirati tudi na nivoju proteinov. Prepoznavni motiv za razgradnjo s kompleksom ClpXP je po navadi dolg 10 do 12 aminokislin. Lahko ga dodamo na N- ali C-konec proteina, ki ga izražamo. Najbolj znana N-končna oznaka je OmpA, najbolj znana C-končna pa SsrA<ref>Baker, T. A. & Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1823, 15–28 (2012).</ref>. Kompleks ClpXP se endogeno izraža v E.coli, vendar pa ga je v razredčenem citoplazemskem ekstraktu premalo, da bi omogočal učinkovito razgradnjo tarčnih proteinov. Za povečanje učinkovitosti razgradnje moramo posledično v reakcijsko mešanico za brezcelično izražanje proteinov dodati vektor z zapisoma za proteina ClpX in ClpP, ki sestavljata kompleks ClpXP. Noireaux in sodelavci so dokazali, da z uporabo različnih koncentracij plazmida, ki ima pod kontrolo promotorja P70 zapisa za ClpX in ClpP, v brezceličnem sistemu lahko dosežemo različne hitrosti razgradnje proteina deGFP-ssrA. Največja hitrost, s katero so uspeli razgraditi 5 μg proteina deGFP-ssrA, je bila 265 nM/min, kar je približno 40-krat hitreje kot v sistemu brez vektorja z zapisom za ClpXP<ref name="vir 7" />.
Možnosti uporabe sistema
Sistem za brezcelično izražanje proteinov je uporaben za različne aplikacije, med katerimi so najpomembnejše sestavljanje genetskih vezij, priprava minimalnih celičnih sistemov in proizvodnja bakteriofagov<ref name="vir 7" />.
Sestavljanje genetskih vezij
Kadar v vezju zaporedno uporabimo več različnih promotorjev, ki jih prepoznavajo različni faktorji σ, je za čim večjo specifičnost in čim večjo količino končnega produkta pomembno, da upoštevamo, da se mora prvi gen v vezju izražati pod kontrolo promotorja P70 oz. ob prisotnosti faktorja σ70, faktorji σ in pripadajoči promotorji v nadaljevanju vezja pa morajo biti razvrščeni od najšibkejšega do najmočnejšega in od najbolj specifičnega do najmanj specifičnega. Znanstveniki so ob upoštevanju teh pravil v brezceličnem sistemu uspešno pripravili 5- in 6-stopenjsko genetsko vezje, pri čemer so v obeh primerih v prvi stopnji pod kontrolo promotorjev P70 iz dveh ločenih vektorjev izrazili faktor σ54 in protein ntrC. Izražena proteina sta nato po principu logičnih vrat IN sprožila transkripcijo faktorja σ38, ki se je izražal pod kontrolo promotorja P54. Sledila je kaskada izražanja ustrezno razvrščenih faktorjev σ, ki je v zadnji stopnji pripeljala do izražanja deGFP. Na podoben način so uspeli sestaviti tudi povratno zanko, z uspešno sintezo barvila violaceina pa so dokazali tudi, da komplet reagentov myTXTL omogoča izražanje in delovanje encimov različnih biosintetskih poti, ki jih endogeno v E.coli ne najdemo<ref name="vir 7" />.
Priprava minimalnih celičnih sistemov
Da brezcelični sistem na osnovi E.coli lahko uporabimo tudi za pripravo minimalnih celičnih sistemov, so Noireaux in sodelavci dokazali tako, da so 5- in 6-stopenjsko vezje, ki sta opisani zgoraj, enkapsulirali v liposome. Obe vezji sta tudi po enkapuslaciji omogočali izražanje deGFP, vendar pa je bilo izražanje ob enkapsulaciji nižje, kot če so bili vektorji prosti v raztopini, kar je posledica omejene količine reagentov znotraj liposomov. Večjo količino proteina deGFP so v liposomih lahko proizvedli, če so v reakcijski mešanici iz ustreznega plazmida predhodno izrazili toksin α-hemolizin, ki v membrani liposomov tvori pore in s tem omogoča prehajanje snovi med liposomi in okoliško raztopino<ref name="vir 7" />.
Proizvodnja bakteriofagov
V brezceličnem sistemu myTXTL so uspeli proizvesti tudi bakteriofage z različnimi genomi. Dokazali so, da je sinteza bakteriofagov T7 (dsDNA) in ΦX174 (ssDNA) učinkovitejša kot v predhodnih sistemih za brezcelično izražanje. Proizvodnjo bakteriofagov T7 v brezceličnem sistemu myTXTL lahko za 10- do 100-krat povečamo, če v reakcijsko mešanico dodamo dNTP-je, saj s tem omogočimo podvajanje bakteriofagnega genoma. Še dodatno povečanje lahko dosežemo, če skupaj z dNTP-ji dodamo tudi PEG8000, saj s tem povečamo gostoto molekul, s čimer okolje približamo razmeram v celicah. myTXTL je tudi prvi sistem za brezcelično izražanje, v katerem so uspeli pripraviti bakteriofag z RNA genomom, MS2<ref name="vir 7" />.
Zaključek
S pripravo brezceličnega sistema samo na osnovi E.coli so Naireuox in sodelavci razširili možnosti uporabe brezceličnih sistemov, z oblikovanjem komercialno dostopnega kompleta reagentov pa so uporabo takšnih sistemov olajšali tudi drugim znanstvenikom, predvsem tistim s področja medicine, bionanotehnologije in biofizike<ref name="vir 7" />.
Viri
<references/>
