Interakcije fagov s človeškimi tkivi
Človeško telo je dom številnih bakteriofagov, raznolike skupine virusov, ki okužijo bakterije. Za znanstvenike so bakteriofagi zanimivi iz vidika uporabe za zdravljenje nekaterih bakterijskih okužb, vendar kljub velikemu številu znanstvenih raziskav, mehanizem interakcije med fagom in človeškim tkivom še vedno ni popolnoma jasen. Fagi lahko prehajajo preko endotelija, ampak nimajo sposobnosti, da bi okužili evkariontske celice. Okužijo lahko zgolj bakterijske celice, saj se pritrdijo na specifične receptorje na bakterijski celični steni.
Fagi v cirkulatornem sistemu
Širjenje fagov poteka izjemno hitro. Bakteriofagi, ki vstopijo v obtočilni sistem morajo pronicati skozi endotelij, da pridejo do želenega organa pri katerem želijo sprožiti terapevtske učinke. Endotelij tvori polprepustno barijero med krvjo in tkivom. Pri normalnih pogojih lahko le majhne molekule ( manjše kot 70kDA ) prosto prehajajo med endotelijem in notranjostjo organa. Pri vnetnih procesih pa lahko tudi večje molekule ( 2000 kDA), namreč vnetni proces poveča prepustnost endotelne bariere. Že dolgo je znano, da je endotelna bariera zelo heterogena po strukturi, kar pa nas privede do por imenovanih fenestare, ki uravnavajo izmenjavo snovi med tkivom in žilami. Poznamo več vrst velikosti por, kot tudi različne velikosti fagov, ki pa bi lahko prosto prehajali skozi te pore v želene organe. Poznamo več tipov prenosa materiala preko endotelne membrane kot so fagocitoza, makropinocitoza, s klatrinom posredovana endocitoza ter preostali energijsko neodvisne endocitotni mehanizmi. Zelo potencialen za terapevtsko uporabo pri zdravljenju bakterijskih infekcij je bakteriofag M13. Pri njem so ugotovili, da lahko prehaja zgolj čez epitelijska tkiva z CME ( klatrinsko posredovana endocitoza ) ter makropinocitozo. Dokazi kažejo tudi na to, da so se fagi sposobni vezati na receptorje na membranah celic. Ena od študij prikaže kako so spremljali internalizacijo bakteriofaga M13, kateremu so izrazili celične prodorne proteine oz. CPP (angl. Cell-penetrating peptides) vrste 3D8 VL in pa TAT pri epitelijskih HelA celicah. Vsak CPP je interagiral z celični receptorji, da je sprožil endocitozo. Zanimivo je, da je vsak CPP izbral drugačno pot endocitoze, namreč bakteriofag M13 z peptidom 3D8 VL se je endocitiral po CME metodi, medtem ko slednji z izraženim TAT peptidom se je endocitiral z kaveloarno endocitozo oz. CavMe. Po endocitozi so se internalizirani bakteriofagi lokalizirali v endosomalnih odsekih, torej endoplazemskem retikulumu in golgijevem aparatu. Kljub temu je večina bakteriofagov končala v lizosomu, kjer so se kasneje razgradili. Ugotovili so tudi, da so izpostavljeni ß3 integrini na celični membrani še ena od možnosti, ki bi jih fagi lahko uporabili za vstop v celico.
Odziv imunskega sistema na bakteriofage
Ob vstopu v obtočilni sistem bakteriofagi aktivirajo imunski sistem. Problem terapije z bakteriofagi je nastanek protiteles proti le tem, saj so bakteriofagi že naravno prisotni v našem okolju. Protitelesa so odkrili v 81% zdravih ljudi, ki niso bili deležni predhodne terapije s fagi. Prevelika uporaba terapije s fagi bi povzročila pretirano proizvodnjo protiteles, kar pa bi povzročilo težjo uporabo fagov za terapevtska zdravljenja. Lako bi tudi spremenili kapsidne proteine s katerimi bi omogočili, da bi se bili fagi sposobni izogniti makrofagnemu sistemu, imeli pa bi tudi podaljšano cirkulacijo ter posledično podaljšan terapevtski učinek.
Fagna fagocitoza
Bakteriofage lahko fagocitirajo človeške celice, zato tudi človeško telo igra glavno vlogo pri čistki fagov. Enojedrni fagocitni sistem (ang. Mononuclear phagocyte system) v jetrih in vranici je odgovoren za filtracijo tujih organizmov, med njimi tudi bakteriofagov iz krvožilja. Vranica in jetra so glavna shramba bakteriofagov, saj je aktivnost fagov tam največja. Fagi pa lahko spodbudijo fagocitozo bakterij preko makrofagov. Fagi torej na nek način označijo bakterijo ter jo naredijo bolj prepoznavno za imunski sistem. Litična aktivnost faga poleg označitve bakterije, tudi poveča učinkovitost odstranitve patogene bakterije. Med fagocitozo bakterije naj bi bakteriofag še naprej liziral fagocitirano bakterijo in tako pomagal v procesu fagocitoze bakterijskega patogena.
Produkcija protiteles proti bakteriofagom
Fagi vsebujejo tesno zapakirano DNA ali pa RNA, ki je obdana s proteinskim plaščem, zato je logično pričakovati, da se bodo v telesu formirala protitelesa proti fagom med fagno terapijo ali pa proti fagom, ki so prisotni v našem okolju. V naravi prisotni bakteriofagi aktivirajo našo humoralno imunost, to je pridobljena imunost pri kateri je specifični imunski odziv pridobljen proti specifičnemu patogenu. Protitelesa pa so producirana od plazma T celic
Bakteriofagi v črevesju
V črevesju sesalcev najdemo veliko število bakterij, ki so potencialne žrtve bakteriofagov. Ti namreč predstavljajo 90% vseh virusov v gastrointestinalnem traktu. Vstop faga v črevesje je največkrat preko oralne administracije, v črevesju se pa le ta sreča z ostrimi življenjskimi pogoji, kot je visoka kislost, proteolitična aktivnost encimov, anaerobno okolje in odziv imunskega sistema. Večina fagov ne preživi pH nižjega od 2, vendar so pa nekatere vrste razvile acidno rezistenco. prva zaščita pred vstopom patogena v notranjost organizma je črevesna mukusna bariera. Sestavlja jo zunanji mukusni sloj, ki je sekretorni ter notranji mukusni sloj, ki je vezan na površje celic. Pod mukusom se nahaja plast črevesnih epitelijskih celic. Nekateri eksperimenti potrjujejo fagni prehod iz črevesja, saj so po oralni administraciji opazili povišano koncentracijo fagov v krvi prostovoljca, medtem ko so drugi eksperimenti to teorijo ovrgli. Teoretično lahko fagi prehajajo čez črevesni epitelij na različne načine.
Prehod z mukusnimi glikoproteini
Mukus je gelu podobna sluzasta snov sestavljena pretežno iz vode in glikoproteinov, ki so zelo različni, kar omogoča fagu variabilnost proteinskih vezav. Domneva se, da pri interakciji igrajo pomembno vlogo Imunoglobulinu-podobne proteinske domene na kapsidi faga. Pri evkariontih Ig-superdružina sodeluje pri vezavnih procesih, prepoznavanju antigenov in služijo kot receptorji na T-limfocitih.
Vloga Hoc proteina pri interakcijah
Hoc protein (visoko imunogeni zunanji kapsidni protein) je protein na kapsidi faga T4 kateri ima Ig-podobne domene. Raziskovalci so naredili še teoretičen test analize gena hoc. S poravnavo proteinskih in nukleinskih zaporedij so našli kratek odsek identičnega zaporedja 20 aminokislin med Hoc genom in IRF-2BP2 (interferon regulatoren faktor 2 vezavni protein 2). Ta fragment kodira aminokislinski motiv PEPEGE, ki se pri evkariontskih proteinih nahaja izven aktivnega mesta, zato domnevno nima funkcije. Homologija teh proteinov kaže na ko-evolucijski razvoj, ki je bil za fage potreben, če so želeli preživeti v črevesnem okolju. Ti proteini bi naj sodelovali pri zaščiti bakteriofaga pred razgradnjo, saj ga fagi, katerih naravno okolje ni gastrointestinalni trakt, nimajo. Sestavlja ga globularna glava, ki »štrli« iz površja kapside, vrat in baza katera pritrjuje protein na sredino heksamerov sestavljenih iz gp23 proteinov. Gen za Hoc protein (gpHoc) kodira štiri Ig-podobne proteinske domene, vezava z glikanom pa je šibka, vendar je število teh vezal veliko. Takšna interakcija omogoča fagu stacioniran položaj v mukusu oz. mu omogoča difuzijo v nižje plasti. Že vezani fagi onemogočijo bakteriji vezavo na mukos in s tem okužbo evkariontske celice, drugič pa zagotavljajo brez-gostiteljski sloj imunosti, saj lahko lažje okužijo že zasidrane bakterije, jih uničijo preko litičnega cikla in tako zreducirajo število bakterij v črevesju.
Imunski odziv v črevesju
V mukusu najdemo tudi deset različnih transmembranskih mucinov, ki so prav tako glikoproteini. Vezava liganda na C-terminalno domeno sproži avto-fosforilacijo in signalno transdukcijo, ki med drugim vključuje aktivacijo T-limfocitov. Epitelijske celice črevesne sluznice na svoji površini izražajo CD61 (trombocitni glikoprotein IIIa), ki sodelujejo pri imunskem odzivu. To so ß3 integrini na katere se vežejo ligandi s specifičnim aminokislinskim zaporedjem katerega imenujemo RGD motiv (arginin-glicin-asparagin). Na kapsidi bakteriofabov T4 so našli protein gp24 z KGD motiv (lizin-glicin-asparagin) za katerega velja, da je analog RGD motiva. Pri interakciji faga T4 z dendritno celico lahko pride do inhibicije imunskega odziva, tako da fag sodelujejo pri inhibirajo IL-10 (interlevkin 10). Fagocitoza T4 faga bi naj tudi inhibira vse kasnejše fagocitozne procese kar kaže na imunosupresivno delovanje. Drugi fagi lahko ob stiku z epitelijsko celico prožijo nastajanje IL-6, ki poveča sekrecijo IgA. Razni eksperimenti so pokazali povišano raven IgA po oralni adminisraciji fagov.
Endocitno prepoznavanje se začne z endocitozo prostega faga, opsoniziranega faga (to pomeni z vezanim protitelesom in substratom) ali z bakteriofagi okužene bakterije. Fagni epitopi so izpostavljeni patogen prepoznavnim receptorjem PRR znotraj endosomskega predela. V primeru lizogeniziranih bakterij to zahteva razgradnjo bakterijskih membran. Tako se lahko vgrajena DNA faga sprosti skupaj z bakterijsko DNA. Za bakterije okužene s fagi, in za proste bakteriofage je razgradnja virusne kapside tista, ki sprosti bakteriofagne nukleotide, kar omogoča zaznavanje PRR. PRR vključuje številne endosomsko povezane TLR (Toll-like receptors), ki prepoznajo nukleinske kisline: TLR3 (veže dsRNA in poli I: C), TLR7 in 8 (veže ssRNA in poli dT) in TLR9 (veže CpG DNA). Citoplazmatsko prepoznavanje fagne DNA znotraj evkariontskega gostitelja še ni opisano, vendar se najverjetneje pojavi pri fagu, ki okuži znotrajcelične bakterije, kot so Chlamydia, Mycobacterium in Listeria. Najbolj zapleten del te aktivacijske poti je dostop nukleinske kisline faga do citoplazemskega prostora. Epitopi znotrajceličnega bakteriofaga bodo verjetno postali izpostavljeni v citoplazmi bodisi zaradi bakterijske smrti bodisi z bakteriofagi povzročene bakterijske lize. Bakterifagno DNA v citoplazmi bi lahko prepoznali po nukleotidnih senzorjih, kot so cGAS-STING ali AIM2-podobni receptorji. Fagna RNA lahko signalizira prek RIG-1 podobnih receptorjev (RIG-1 ali MDA5).
Fagi v možganih
Zaradi strogo reguliranega sistema prehajanja v krvno možgansko pregrado (BBB) prenos zdravil v centralni živčni sistem predstavlja veliko oviro. . Rešitev predstavljajo fagi, ki so že dolgo znani po tem, da se kopičijo v možganih, tako da očitno prehajajo BBB z lahkoto. Mehanizem kako bakteriofagi vstopijo v BBB še ni poznan. Poznanih pa je veliko poskusov, kjer so v možgane namerno injicirali bakteriofage in spremljali njegove učinke v možganih. Prva pomembnejša raziskava je bila, ko so leta 1943 pokazali kopičenje in razmnoževanje abakteriofaga anti-Shiga. Bakteriofag Anti-Shiga, ki se vbrizga v splošni obtok, se lahko v možganih miši, okuženih z bakterijo Shigella dysenteriae, množi v možganih. Nedavne študije kažejo, da se bakteriofag M13, zelo veliki nanodelci(~900 nm), vežejo na β-amiloidne in α-sinukleinske proteine, kar vodi v razčlenitev plakov na modelih Alzheimerjeve in Parkinsonove bolezni. Da bi določili izvedljivost, varnost in značilnosti konvekcijskega dovajanja nativnega nitastega bakteriofaga M13 v možgane, je Ksendzovsky s skupino raziskovalcev možgane primatov perfutiral z bakteriofagom. Med zdravljenjem so bile vse živali nevrološko aktivne, brez dokazov o toksičnosti, medtem ko so opazili, da se fagi širijo po možganih primatov z aksonskim transportom. Pokazalo se je tudi, da fagi vežejo amiloidne beta plake, rake in tumorske celice, kar kaže na potencialno terapevtsko vlogo v možganih. Z bakteriofagom T4 so dokazali, da le-ti zavirajo rast tumorja v možganih miših. Predlagan je možni molekularni mehanizem teh učinkov, in sicer specifična interakcija med motivom Lys-Gly-Asp fagnega proteina 24 in receptorji beta3-integrina na ciljnih celicah (to so celice mišjega melanoma). Ugotovljeno pa je bilo, da blokiranje beta integrinov z bakteriofagi povzroči znatno zmanjšanje invazivnosti tumorja. Zgodnjo diagnozo Alzheimerjeve bolezni preprečimo s pomanjkanjem sredstev za vizualizacijo in ciljanje β amiloidnih oblog v možgane prizadetih ljudi in vivo. Intranazalno vstavljanje inženirsko narejenega nitastega faga M13 faga kot vektorja fragmenta anti-β amiloidnega protitelesa v miši z Alzheimerjevo boleznijo omogoča in vivo targetiranje β amiloidnih oblog. Fagi, ki se vežejo na β-amiloidne in α-sinukleinske ploščice, ki so povezani z Alzheimerjevo in Parkinsonovo boleznijo, so olajšali razpad in odstranjevanje teh napačno zvitih proteinov v možganih.
Viri
1. Barr, J. J. A bacteriophages journey through the human body. Immunol. Rev. 279, 106–122 (2017). 2. Huh, H., Wong, S., St. Jean, J. & Slavcev, R. Bacteriophage interactions with mammalian tissue: Therapeutic applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 145, 4–17 (2019). 3. Carroll-Portillo, A. & Lin, H. C. Bacteriophage and the innate immune system: Access and signaling. Microorganisms 7, 1–11 (2019). 4. Tian, Y. et al. Probing the Endocytic Pathways of the Filamentous Bacteriophage in Live Cells Using Ratiometric pH Fluorescent Indicator. Adv. Healthc. Mater. 4, 413–419 (2015).
