Razvoj riža za proizvodnjo fragmentov protiteles proti humanemu norovirusu.

Norovirus je enoverižni RNA virus brez virusne ovojnice. Okuži lahko različne sesalske organizme in povzroča akutni gastroenteritis (okužbo prebavil). V pogovornem jeziku se za to bolezen pogosto uporablja izraz trebušna gripa, čeprav povzročitelj le-te ni virus gripe. Humani norovirus lahko prizadene ljudi vseh starostnih skupin, ranljive skupine pa so predvsem otroci, starejši in ljudje z oslabljenim imunskim sistemom [1]. Kljub temu, da posledice okužbe po večini niso nevarne (driska, bruhanje, bolečine v trebuhu), po ocenah zaradi te bolezni letno umre med 70.000 in 200.000 ljudi. Človek je dovzeten za okužbo z norovirusi iz skupine GI, GII in GIV, znotraj katerih obstaja veliko genotipov [2]. Prenaša se z okuženim materialom (hrano, pijačo, izločki). Na tržišču trenutno še ni zdravila za zdravljenje in nadzor nad boleznijo [1].

MucoRice

Raziskovalci so v rižu vrste japonica (Nipponbare) proizvedli protitelesa proti humanemu norovitusu GII.4 (seva 2006b in Sydney_2012) oziroma GII.17 (sev Kawasaki_2015). To so t. i. VHH protitelesa, kjer gre za variabilno domeno fragmentov težke verige laminih protiteles (VHH - a variable domain of a llama heavy-chain antibody fragment). Z virusom podobnimi delci (VLP – virus-like particle) norovirusa GII.4 oziroma GII.17 so imunizirali lame in tako pridobili več klonov VHH. S predstavitvijo na bakteriofagih pa so izbrali dva klona; 7C6 proti GII.4 in 1E4 proti GII.17 [1].

Snovanje in izvedba eksperimenta

Zasnovana sta bila dva tipa transgenega riža. Prvi je izražal monomerni VHH 7C6 proti GII.4, drugi pa heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17. V obeh primerih so uporabili binarni T-DNA vektor (pZH2Bik45G1B), v katerega so poleg enega oziroma drugega zapisa vstavili tudi konstrukt za RNA interferenco. S tem so v riževih zrnih zmanjšali izražanje prolamina in glutelina, ki sta poglavitna založna proteina, in tako vplivali na visoko vsebnost rekombinantnega proteina v zrnih. Transformacijo riževih rastlin s pripravljenima vektorjema so izvedli z Agrobacterium tumefaciens. Tako vzgojene transgene rastline so rasle pri pogojih: 12 urna fotoperioda, med osvetljenim delom cikla pri 27°C oz. 22°C v nočnem delu cikla. Iz zrn so pripravili riževo moko in s pufrom ekstrahirali vse proteine, nato pa v raztopino PBS ekstrahirali protein VHH. Po centrifugiranju so za nadaljnje eksperimente uporabili riževo vodo (supernatant), kjer se nahaja topen VHH.

• Vsebnost akumuliranih VHH so določili z analizo SDS-PAGE (barvanje s Coomassie Brilliant Blue - CBB) in prenosom po Westernu. Intenziteto linij (na gelu oz. membrani) VHH iz riža (monomerni VHH 7C6 oz. heterodimerni VHH 7C6-1E4) so primerjali z intenziteto linij standarda (rekombinantni homodimerni VHH 7C6 in heterodimerni VHH 7C6-1E4). Vzporedno so namreč v celicah Escherichia coli pripravili tudi dva rekombinantna proteina*, ki so ju izolirali, očistili z uporabo Ni kolone ter uporabili kot standard (njuna koncentracija je bila določena na podlagi teoretične absorbance pri valovni dolžini 280 nm).

*V celicah Escherichia coli (Rosetta 2 (DE3) pLysS) proizvedena rekombinantna proteina sta: homidimerni VHH, ki ga tvorita dve VHH 7C6 zaporedji povezani z zaporedjem (GGGGS)3, ter rekombinantni heterodimerni VHH, katerega C konec predstavlja zaporedje 1E4, N konec zaporedje 7C6, povezuje pa ju vmesnik (GGGGS)4.

• Učinkovitost tako proizvedenih protiteles (tistih iz riža kot tudi tistih iz Escherichia coli) so preizkusili na epitelnih črevesnih celicah (pridobljenih iz humanih induciranih pluripotentnih celic) - IEC (human induced pluripotent stem-cellderived intestinal epithelial cells).
• S primarnimi in konjugiranimi sekundarnimi protitelesi so na rezinah riževih zrn označili prolamin, glutelin in 7C6 ter z imunofluorescenčno mikroskopijo določili intenziteto fluorescence prolamina in glutelina. Podobno so tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo opazovali porazdelitev VHH ter obeh založnih proteinov v riževih zrnih [1].

Rezultati

Z analizo intenzitet linij VHH (iz riža) na gelu so ugotovili, da je v povprečju nivo izražanja 7C6 enak 7,17 mg/g riževih zrn, za 7CH-1E4 pa 4,63 mg/g zrn. Povprečen izkoristek topnega 7C6 je znašal 5,39 mg/g riževe vode oz. 2,78 mg/g riževe vode. Učinkovitost ekstrakcije 7C6 oz. 7CH-1E4 s PBS iz riževe moke je bila torej 75,1% oz. 59,9%. Z imunofluorescenčno mikroskopijo so pokazali, da je prisotnost prolamina in glutelina v riževih zrnih, ki izražajo 7C6 oz. 7C6-1E4, občutno manjša, kar potrjuje učinkovitost RNA interference za zaviranje izražanja teh dve založnih protinov. Slednje so potrdili tudi z imunotranskmisijsko elektronsko mikroskopijo. Nevtralizacijska sposobnost v rižu proizvedenih heterodimernih VHH 7C6-1E4 se je izkazala za bolj učinkovito (tako proti norovirusu GII.4 kot proti GII.17) v primerjavi z monomernim VHH 7C6. Vpliv dimerizacije VHH na povečano sposobnost nevtralizacije je potrdil tudi rezultat obeh rekombinantnih proteinov (homodimer 7C6 in heterodimer 7C6-1E4), proizvedenih v Escherichia coli. Učinkovitost obeh je bila namreč večja od monomernega 7C6, proizvedenega v rižu, in primerljiva s heterodiemernim 7C6-1E4, prav tako proizvedenim v rižu. Za slednjega so pokazali, da nevtralizacijsko sposobnost obdrži tudi ob predhodni toplotni obdelavi (90°C, 20 min) [1].

Zaključek

Kljub manjši ekspresiji heterodimera VHH 7C6-1E4 v riževih zrnih napram monomeru VHH 7C6, je heteordimerni VHH v primerjavi z monomernim izkazoval večjo učinkovitost nevtralizacije norovirusa GII.4_2006b in GII.4 Sydney_2012. Ob enem pa VHH 7C6-1E4 nevtralizira tudi norovirus GII.17 [1]. V razvoju so sicer cepiva na podlagi virusom podobnih delcev (VLP) proti GII.4 in GI.1, ne pa tudi proti novim oblikam virusa (GII.17). Prav tako za omenjena cepiva še ni podatka o primernosti njihove uporabe za ranljivejše skupine, za protitelesa VHH pa poročajo o učinkoviti in varni uporabi tudi pri slednjih [3], [4]. V rižu proizveden heterodimerni VHH 7C6-1E4 proti GII.4 in GII.17 tako predstavlja učinkovino, ki je tudi temperaturno in pH stabilna ter zato potencialno primerna za oralno inumoterapijo [1].

Viri

[1] Sasou, A. et al. Development of Antibody-Fragment – Producing Rice for Neutralization of Human Norovirus. Front. Plant Sci. 12, (2021).

[2] Chhabra, P. et al. Updated classification of norovirus genogroups and genotypes. J. Gen. Virol. 100, 1393–1406 (2019).

[3] Moonens, K. et al. Structural insight in the inhibition of adherence of F4 fimbriae producing Enterotoxigenic Escherichia coli by llama single domain antibodies. Vet. Res. 46, 1–7 (2015).

[4] Tremblay, J. M. et al. A single VHH-based toxin-neutralizing agent and an effector antibody protect mice against challenge with Shiga toxins 1 and 2. Infect. Immun. 81, 4592–4603 (2013).