TheraPUFA: nazalni probiotik proti okužbam in vnetjem

Therapufa [1] je iGEM-projekt iz leta 2020, ki je bil nagrajen s prvim mestom za najboljši terapevtski projekt. Avtorji projekta so študenti univerze William & Mary v Williamsburgu, Virginia.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary

Avtorica povzetka: Barbara Slapnik

Uvod – Kaj je TheraPUFA?

TheraPUFA je nazalni probiotik, ki omogoča sintezo polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA), s katerimi uravnava vnetje in deluje protivirusno. Ideja projekta je posledica pandemije koronavirusa SARS-CoV-2, ki je pripomogla k hitrem razvoju cepiv, diagnostičnih orodij in zdravil, ki vključujejo protivirusne učinkovine.

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA)

Polinenasičene maščobne kisline (PUFA) lahko delujejo kot endogene antibakterijske, antivirusne in antiparazitske spojine, poleg tega pa lahko preko svojih metabolitov regulirajo tudi procese vnetja. Inaktivirajo lahko viruse z lipidno ovojnico (npr. herpes, influenza, SARS-CoV-2), tako da povzročijo lizo celic oziroma puščanje membrane, inhibirajo proliferacijo različnih mikroorganizmov, preprečujejo preureditev lipidnega dvosloja in vplivajo na interakcijo med virusom in receptorjem [2]–[7]. Med PUFA uvrščamo arahidonsko kislino (AA) in dokozaheksaenojsko kislino (DHA), ki so jih uporabili pri načrtovanju nazalnega probiotika. AA lahko povzroči lizo lipidnih ovojnic virusa, njeni metaboliti pa učinkujejo provnetno in protivnetno. Obe uporabljeni PUFA pa zavirata replikacijo +RNA virusov, saj spremenita lipidno sestavo in tako virusom onemogočita preureditev membran in njihovo razmnoževanje. Za metabolite DHA so značilni le protivnetni učinki.

Izbira bakterij

Za izbiro probiotične šasije so iskali vrsto bakterij, ki bi izpolnjevala tri pogoje:

• bakterija mora biti naravno del nosno-žrelnega mikrobioma,

• ne sme povzročati bolezni ali povečati tveganje za razvoj bolezni v zdravih posameznikih,

• bakterija je že bila uporabljena kot nazalni probiotik.

Pri projektu so se odločili za bakterijo Neisseria cinerea, gram negativno bakterijo, ki jo najdemo v nazalni in oralni mikrobioti zdravih odraslih in otrok. N. cinerea je komenzalna bakterija, ki preprečuje rast patogenih bakterij, uvrščamo jo v 1. biološki varnostni razred, ne povzroča bolezni in ni znano, da bi sodelovala pri bolezni. Pri izbiri bakterije so morali upoštevati še kompatibilnost s predhodno izbranim citokinskim senzorjem, ki se uspešno izraža v gram negativnih bakterijah. Bakterije so razdelili v dve skupini in pripravili dve različni vezji. V prvo skupino bakterij so vstavili vezje, ki je omogočilo proizvodnjo AA, medtem ko je bila druga skupina bakterija prilagojena na proizvodnjo DHA. Uravnavanje sinteze ustrezne PUFA je zagotavljal citokinski senzor, ki se je odzval na vnetje v telesu. Obe skupini bakterij sta vsebovali še dve varnostni stikali, ki sta zagotovili varnost probiotika.

Načrtovanje vezja

Prva skupina bakterij je bila odgovorna za sintezo AA, njeno vezje je bilo sestavljeno iz promotor pspA, s katerim je bila pogojena sinteza represorja cI. Represor cI je s svojo vezavo na operator promotorja pLac inhibiral izražanje fosfolipaze cPLA2, ki je sodelovala pri transportu sintetizirane PUFA. AA sintaza je bila zapisana pod konstitutivnim Andersonovim promotorjem J23. V drugi skupini bakterij, je bilo vezje podobno, vendar sinteza ni bila uravnana s represorjem cI.

Moduli, ki sestavljajo TheraPUFA

Citokinski senzor

Pri projektu so želeli oblikovati senzor za zaznavanje IFN-γ in TNF-α, ki bi reguliral sintezo AA in DHA. V ta namen, so uporabili sintetični citokinski senzor, ki sta ga predhodno razvila raziskovalca Aurand in March [8]. Osnova tega senzorja je zunanji membranski porin A (OmpA) iz E. coli, ki so mu zamenjali dve zunajcelični zanki z zunajceličnima zankama proteina OrpF. Z zamenjavo zank so omogočili zaznavanje IFN-γ in TNF-α. Pri nizkih koncentracijah IFN-γ in TNF-α senzor ni aktiven. Transkripcijski faktor PspF, ki omogoči proizvodnjo DHA, je inhibiran. DHA se ne izloča v zunajcelični prostor. Ko so v okolici bakterije prisotne zadostne koncentracije IFN-γ in TNF-α, se citokinski senzor aktivira, signal se preko OmpA proteina prenese do membranskih proteinov PspB, PspC in PspA, kar povzroči spremembe interakcij med proteini in inhibicija transkripcijskega faktorja PspF je prekinjena. Aktiven transkripcijski faktor PspF se lahko veže na operatorsko regijo PspA promotorja in inducira proizvodnjo DHA. V prvi skupini bakterij, ki so odgovorne za sintezo AA, transkripcijski faktor PspF aktivira izražanje represorja in transport AA je onemogočen. Ker le visoke koncentracije citokinov aktivirajo citokinski senzor, pride do preklopa med izločanjem AA in DHA le v primeru prekomernega imunskega odziva.

Sinteza polinenasičenih maščobnih kislin (PUFA)

Za sintezo AA so uporabili zapis za PUFA sintazo iz Aureispira marina, ki omogoča de novo sintezo AA. Za sintezo DHA pa so uporabili zapis za PUFA sintazo iz Scizochytrium, ki omogoča de novo sintezo DHA.

Transport polinenasičenih maščobnih kislin

Pri oblikovanju sistema za transport PUFA so pri projektu izhajali iz gram negativne bakterije Rhodobacter sphaeroides, ki lahko izloča dolge maščobne kisline v zunajcelični prostor. Sistem temelji na fosfolipazi, ki se nahaja v periplazmi in sprošča maščobne kisline iz fosfolipidov notranje membrane. Maščobne kisline se nato izločijo v zunajcelični prostor, po neznanem mehanizmu, ki ni odvisen od proteina Tol-C. Sistem za transport PUFA so prilagodili, tako da so izbrali acil-sintetazo in fosfolipazo, z večjo preferenco do PUFA. Izbrana acil-sintetaza omogoči, aktivacijo PUFA in sintezo fosfolipidov. Fosfolipaza je pomembna za sproščanje PUFA iz fosfolipidnega dvosloja v periplazmo. Prvi korak pri proizvodnji in transportu AA je sinteza PUFA in vgradnja v notranjo celično membrano. Ker je vgradnja AA v fosfolipide značilna že v wt celicah, jim sistema ni bilo potrebno bistveno prilagajati. V drugem koraku je pomembna cPLA2, ki se s pomočjo CycA lokalizacijskega signala izloča v periplazmo in omogoči sproščanje AA iz notranje membrane v periplazemski prostor. V tretjem koraku gre za prehod AA iz periplazemskega v zunajcelični prostor. Ker je bakterijska membrana neprepustna za maščobne kisline in pasivna difuzija ni možna, so pri projektu predpostavili olajšan transport PUFA preko proteinskega transporterja. FadL je transporter dolgih maščobnih kislin, ki prenaša maščobne kisline v periplazmo. Predvidevali so, da mora obstajati protein podoben proteinu FadL, ki bi omogočil olajšan transport PUFA iz periplazme v zunajcelični prostor. DHA se za razliko od AA v nativnih celicah akumulira v citoplazmi v obliki prostih maščobnih kislin. Za sintezo DHA so pri projektu uporabili PUFA sintazo iz Schizochytrium. Poleg tega so dodali še zapis za fosfopantetinil transferazo iz Nostoc cianobakterij, ki postranslacijsko modificira DHA sintazo in je nujna za sintezo DHA [9]. Za vgradnjo DHA v membrano, se mora DHA še aktivirati z dodatkom CoA. Za aktivacijo so v bakterije vnesli zapis za acil-CoA sintetazo lacsA iz Thalassiosira pseudonana, ki omogoči prenos CoA iz acetil-CoA na DHA. Aktivirana DHA se nato s pomočjo encimov vgradi v notranjo membrano. Za sproščanje DHA iz notranje membrane v periplazmo so uporabili človeško fosfolipazo iPLA2, ki so ji dodali CycA lokalizacijski signal za prehod v periplazmo. Transport DHA v zunajcelični prostor pa naj bi potekal na enak način kot transport AA.

Varnostni modul z dvema stikaloma

Prvo stikalo zagotavlja varnost probiotika v človeškem telesu. Z vklopom stikala pride do eliminacije probiotika iz organizma. Za stikalo so konstruirali aspirin-inducibilni ekspresijski sistem. Uporabili so promotor PsaI, ki zapisuje za zeta toksin in je odvisen od transkripcijskega faktorja SalR. Transkripcijski faktor SalR je zapisan pod konstitutivnem promotorjem PopaB in lahko obstaja v dveh oblikah: SalRr in SalRa. V obliki SalRr deluje kot represor, medtem ko v obliki SalRa s svojo vezavo aktivira transkripcijo toksina. SalR bo v odsotnosti aspirina deloval kot represor, ki bo zaviral izražanje zeta toksina. Ob dodatku aspirina bo SalR začel delovati kot aktivator in izražati se bo začel zeta toksin, ki bo inhibiral sintezo petidoglikanov in prišlo bo do lize celic. Drugo stikalo preprečuje, da bi bakterije iz TheraPUFA preživele v okolju (zunaj gostitelja), saj prepreči replikacijo bakterij pri temperaturi nižji od 37 °C. Stikalo je uravnano s FitAB toksin-antitoksin sistemom, ki so ga združili z RNA termometrom CssA. CssA je RNA termometer, ki pri temperaturi nižji od 37 °C oblikuje lasnično zanko in blokira vezavo ribosoma na RBS. Toksin FitB in antitoksin FitA sta zapisana pod nativnim promotorjem. Pred zapis za antitoksin FitA so dodali še CssA, ki uravnava izražanje antitoksina. Pri temperaturi 37 °C se bosta izražala tako toksin FitB, kot antitoksin FitA, zato bo delovanje toksina inhibirano. Pri temperaturi nižji od 37 °C, pa bo izražanje antitoksina FitA ustavljeno zaradi tvorbe lasnične zanke CssA in toksin FitB bo aktiven.

Optimizacija prvotnega modela

Da bi lahko TheraPUFA uporabljali kot protivirusno učinkovino, bi morali model še prilagoditi:

• S pomočjo mestnospecifične mutageneze bi morali povečati občutljivost sintetičnega citokinskega receptorja.

• Povečati bi morali sintezo PUFA.

• Z uporabo posebnih gelov, ki se uporabljajo pri vnosu probiotika bi morali povečati obstojnost vnesenih bakterij v nosni votlini.

Zaključek

Predstavljen projekt TheraPUFA je delo študentov univerze William & Mary, ki so ga pripravili za tekmovanje iGEM 2020. Zaradi pandemije koronavirusa SARS-CoV-2 študentje niso imeli dostopa do laboratorija, zato so pripravili idejno zasnovo za nazalni probiotik, pri katerem bi v bakterije Neisseria cinerea vstavili vezje za sintezo PUFA in tako omogočili protivirusno delovanje in uravnavanje pretiranega imunskega odziva, ki je tudi posledica SARS-CoV-2. Idejno zasnovo so nato preverili z matematičnimi parametri, pridobljenimi iz literature. Model je nakazoval, da TheraPUFA ne bi bilo možno uporabljati kot protivirusno učinkovino, kljub temu so naknadno model optimizirali in tako oblikovali nazalni probiotik, ki bi prispeval k zmanjšanju virusne obremenitve.

Viri in literatura

[1] “Team:William and Mary - 2020.igem.org.” [Online]. Available: https://2020.igem.org/Team:William_and_Mary. [Accessed: 07-Apr-2021].

[2] C. Müller, M. Hardt, D. Schwudke, B. W. Neuman, S. Pleschka, and J. Ziebuhr, “Inhibition of cytosolic phospholipase A2α impairs an early step of coronavirus replication in cell culture,” J. Virol., vol. 92, no. 4, p. JVI.01463-17, Nov. 2017.

[3] A. Goc, “Polyunsaturated ω-3 fatty acids inhibit ACE2-controlled SARS-CoV-2 binding and cellular entry.”

[4] U. N. Das, “Can Bioactive Lipids Inactivate Coronavirus (COVID-19)?,” Arch. Med. Res., vol. 51, no. 3, pp. 282–286, Apr. 2020.

[5] U. N. Das, “Response to: Bioactive Lipids and Coronavirus (COVID-19)-further Discussion,” Archives of Medical Research, vol. 51, no. 5. Elsevier Inc., pp. 445–449, 01-Jul-2020.

[6] A. Kohn, J. Gitelman, and M. Inbar, “Unsaturated free fatty acids inactivate animal enveloped viruses,” Arch. Virol., vol. 66, no. 4, pp. 301–307, Dec. 1980.

[7] U. N. Das, “Arachidonic acid and other unsaturated fatty acids and some of their metabolites function as endogenous antimicrobial molecules: A review,” Journal of Advanced Research, vol. 11. Elsevier B.V., pp. 57–66, 01-May-2018.

[8] T. C. Aurand and J. C. March, “Development of a synthetic receptor protein for sensing inflammatory mediators interferon-γ and tumor necrosis factor-α,” Biotechnol. Bioeng., vol. 113, no. 3, pp. 492–500, Mar. 2016.

[9] J. Beld, E. C. Sonnenschein, C. R. Vickery, J. P. Noel, and M. D. Burkart, “The phosphopantetheinyl transferases: Catalysis of a post-translational modification crucial for life,” Nat. Prod. Rep., vol. 31, no. 1, pp. 61–108, Jan. 2014.