Optimizacija fermentacijske proizvodnje pha-bioplastike z b. thuringiensis in z glukozo bogatimi hidrolizati

UVOD

Butil butirat je ester maslene kisline in butanola. Široko je uporabljen kot dodatek v živilski in kozmetični industriji, kot topilo v proizvodnji plastike, vlaken in v procesiranju naftnih produktov, ter kot dodatek k biogorivom [1, 2]. Konvencionalno se pridobiva s kemijsko ali encimsko esterifikacijo butirata in butanola. Ker so prekurzorji za esterifikacijo dragi, je vedno bolj zaželjen postopek proizvodnje s fermentacijo, pri kateri bi lahko uporabili nizkocenovne substrate, kot je na primer glukoza [2].

Ker je proizvodnja prekurzorjev butil butirata v enem samem bakterijskem sevu zelo neučinkovita, so v dotični raziskavi predlagali pripravo kokulture dveh sevov E. coli, pri čemer bi en proizvajal butanol, drug pa butirat. Pretvorbo v butil butirat bi dosegli z dodatkom rekombinantne lipaze v gojišče. Seva naj bi imela skoraj identično genetsko ozadje in zato dokaj podobne optimalne pogoje rasti. V predhodni raziskavi so že pripravili E. coli, sev EB243, ki je sposoben glukozo učinkovito pretvoriti v butanol. Ta sev so uporabili tudi v zgoraj omenjenem konzorciju, poleg tega so v raziskavi njega razvili nov sev, sposoben proizvodnje butirata [2, 3].

PRIPRAVA SEVA ZA PROIZVODNJO BUTIRATA

Biosintezni poti butanola in butirata potekata enako do butiril-CoA, nato pa se razcepita. Butiril-CoA se nato v butanol pretvori preko butanala z delovanjem alkohol/aldehid dehidrogenaze (AdhE2). Za pripravo seva, ki bi proizvajal butirat, so raziskovalci torej uporabili sev EB243ΔadhE2 z izbitim genom adhE2 [2].

V raziskavi so testirali več različnih encimov za pretvorbo butiril-CoA v butirat in za najbolj učinkovito se je izkazala tioesteraza iz organizma H. influenzae (yciAh), zato so delo nadaljevali s tem encimom. Da bi dosegli večjo stabilnost transgena in se znebili odvisnosti fermentacije od uporabe antibiotika, so zapis za tioesterazo prenesli na kromosom seva EB243, in sicer so ga vgradili v gen adhE2 in s tem dosegli hkratno izbitje tega gena. Da so to dosegli, so uporabili sistem CRISPR/Cas9 in na ta način so dobili sev EB243ΔadhE2::yciAh [2, 4].

OPTIMIZACIJA PROIZVODNJE PREKURZORJEV – PREZRAČEVANJE

Sinteza butanola je najbolj učinkovita v anaerobnih pogojih, sinteza butirata pa v aerobnih pogojih, in sicer je bila pretvorba v butirat najugodnejša v primeru prezračevanja s hitrostjo 0,5 vvm. Ker v teh pogojih EB243 proizvede manj butanola, so testirali, kakšno razmerje vcepkov je potrebno, da bo proizvodnja butanola in butirata čim bliže razmerju 1:1 – za najbolj učinkovito se je izkazalo razmerje 1:4 (EB243ΔadhE2::yciAh : EB243) [2].

SESTAVLJANJE CELOTNE POTI PRETVORBE GLUKOZE V BUTIL BUTIRAT

V raziskavi so zadnji korak v pretvorbi dosegli z dodajanjem eksogene rekombinantne lipaze iz organizma Candida sp. v gojišče. Ker poti sinteze prekurzorjev divergirata pri butiril-CoA in se nato spet združita v zadnjem koraku, so raziskovalci kokulturo poimenovali konzorcij “diamantne” oblike.

Kokulturo so gojili v bioreaktorju, in sicer so fermentacijo sprva izvajali pri pH 6 s prezračevanjem hitrosti 0,5 vvm, a izkazalo se je, da je izkoristek dokaj nizek, po končani fermentaciji pa sta v gojišču ostala tudi prekurzorja, in sicer je bilo butirata 7x več kot butanola. Slab izkoristek so torej pripisali nezadostni količini proizvedenega butanola, poleg tega naj bi na izkoristek reakcije esterifikacije vplivalo tudi disociacijsko stanje butirata. Esterifikacija naj bi bila najbolj učinkovita, ko je butirat v nedisociirani obliki, pri nizkem pH [5]. Problem gojenja pri nizkem pH pa je inhibicija celične rasti, zato so v nadaljevanju poskusili s proizvodnjo pri različnih vrednosti pH. Tako so našli kompromis med proizvodnjo in celično rastjo, in sicer je bil to pH 5,8 [2].

Razmerje vcepkov 1:4, ki se je izkazalo za najboljše za gojenje v epruvetah, ni bilo zadovoljivo za proizvodnjo v fermentorju. Zato so razmerje spremenili na 1:8, pri katerem so celice rasle hitreje, kar se je odrazilo tudi v večji količini butil butirata, ne pa tudi v višjem izkoristku. Raziskovalci so zato predlagali izvedbo fermentacije v dveh stopnjah, pri čemer bi v prvi stopnji kokulturo dobro prezračevali (0,5 vvm), kar bi spodbujalo rast obeh sevov in produkcijo butirata. V drugi stopnji bi nato prezračevanje znižali (0,1 vvm), torej bi gojenje potekalo v mikroaerofilnih pogoji, kar bi spodbujalo produkcijo butanola. To metodo so preizkusili in izkazalo se je, da je bil izkoristek najboljši (0,12 g/g glukoze) v primeru 36-urnega aerobnega in nato 72-urnega mikroaerofilnega gojenja [2].

ZAKLJUČEK

V raziskavi so razvili postopek za proizvodnjo butil butirata v enem fermentorju, pri čemer so za proizvodnjo prekurzorjev uporabili konzorcij dveh sevov E. coli. Z optimizacijo prezračevanja, pH in razmerja med vcepkoma so dosegli do sedaj največji titer in izkoristek (7,1 g/L in 0,12 g/g) proizvodnje butil butirata v E. coli.

VIRI

1. M. Sjöblom, P. Risberg, A. Filippova, O. G. W. Öhrman, U. Rova, P. Christakopoulos: In Situ Biocatalytic Synthesis of Butyl Butyrate in Diesel and Engine Evaluations. ChemCatChem 2017, 9(24), str. 4529–4537.

2. J. P. Sinumvayo, C. Zhao, G. Liu, Y. Li, Y. Zhang: One-pot production of butyl butyrate from glucose using a cognate “diamond-shaped” E. coli consortium. Bioresour. Bioprocess. 2021, 8(1), str. 18.

3. H. Dong, C. Zhao, T. Zhang, H. Zhu, Z. Lin, W. Tao, Y. Zhang, Y. Li: A systematically chromosomally engineered Escherichia coli efficiently produces butanol. Metab. Eng. 2017, 44, str. 284–292.

4. Y. Jiang, B. Chen, C. Duan, B. Sun, J. Yang, S. Yang: Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system. Appl. Environ. Microbiol. 2015, 81(7), str. 2506–2514.

5. Z.-T. Zhang, S. Taylor, Y. Wang: In situ esterification and extractive fermentation for butyl butyrate production with Clostridium tyrobutyricum. Biotechnol. Bioeng. 2017, 114(7), str. 1428–1437.