IGEMINI: Kvasovke kot prehransko dopolnilo v vesolju

iGEMINI je projekt v okviru tekmovanja iGEM, ki ga je leta 2020 pripravila ekipa dodiplomskih študentov iz Toulouse v Franciji.

Spletna stran projekta iGEMINI: https://2020.igem.org/Team:Toulouse_INSA-UPS

Avtorica povzetka: Klementina Polanec

Problem

Astronavti so v vesolju izpostavljeni ekstremnemu okolju, ki lahko ima škodljiv vpliv na njihovo zdravje. Večja izpostavljenost sevanju, višje koncentracije CO₂ in mikrogravitacija kratkoročno vplivajo na počutje, dolgoročno gledano pa lahko astronavti začnejo izgubljati mišično maso in kosti, imajo povečano tveganje za kardiovaskularne težave in oslabljeno delovanje imunskega sistema. Uravnotežena prehrana bogata s hranili je za astronavte ključna, saj lahko zmanjša negativne vplive okolja na zdravje [1]. Pomemben del uravnotežene prehrane so vitamini, med katerimi je 13 esencialnih in se priporoča njihovo vsakodnevno uživanje [2].

Trenutno si astronavti na mednarodni vesoljski postaji hrane ne pripravljajo sami, temveč vsakih nekaj mesecev dobijo z Zemlje pošiljko sveže ter dehidrirane in konzervirane hrane [3]. Prvi problem vnaprej pripravljene hrane je, da se med samo pripravo razgradijo številni esencialni vitamini, predvsem manj odporni (vitamin A oziroma retinol, vitamin C, folat in tiamin) [4]. Drug in še večji problem pa je, da se konzervirana hrana shranjuje tudi po več mesecev in daljši čas shrambe pomeni več razgrajenih vitaminov [5]. Tako je na primer razgradnja retinola v odvisnosti od časa eksponentna in po 6 mesecih shrambe se ga razgradi kar 44 % [5, 6].

Zaradi opisanih problemov je v vesolju težje poskrbeti za prehrano dovolj bogato z vitamini, prav tako pa so daljša potovanja po vesolju zaenkrat nemogoča [1,2].

Rešitev: projekt iGEMINI

Ekipa iz Toulouse si je zamislila kokulturo, ki bi jo astronavti lahko gojili na raketi in z njo pridobivali prehranska dopolnila. Ekipa se je odločila za pridobivanje β-karotena (provitamin A), saj je vitamin A eden najmanj stabilnih vitaminov [5], prav tako pa ima pomembno vlogo pri celični diferenciaciji in vidu [7]. Prehransko dopolnilo bi lahko astronavti prilagodili svojemu okusu in s pomočjo optogenetske regulacije izbirali med 3 okusi: naraven okus kvasovke, limona ali sladka vrtnica [6].

Osnove o kokulturi

Kokulturo bi sestavljali kvasovka Saccharomyces cerevisiae in bakterija Clostridium ljungdahlii. Kokulturo so zasnovali na tak način, da bi kot vir ogljika in dušika uporabljala odpadke, ki nastanejo pri recikliranju organskih snovi na raketi. Vir ogljika bi predstavljal CO₂ iz zraka, vir dušika pa organske molekule iz urina [6].

Saccharomyces cerevisiae

Kvasovko bi gensko spremenili, tako da bi lahko proizvajala β-karoten, dodali pa bi ji tudi optogenetske elemente, preko katerih bi s spremembo svetlobe spremenili njen okus [6]. Ker je kvasovka splošno prepoznana kot varna, prav tako pa že sama po sebi proizvaja tudi vitamine B in druga hranila [8], bi jo astronavti lahko uživali kot prehransko dopolnilo [6]. To je že ustaljena praksa na Zemlji [9].

Clostridium ljungdahlii

Ker je kvasovka heterotrofna, ni zmožna uporabljati odpadnega CO₂ kot vir ogljika [10]. Ekipa se je zato odločila za kokulturo z bakterijo C. ljungdahlii, ki lahko raste tudi avtotrofno, pri čemer reducira CO₂ do organskih spojin, kot vir elektronov pri pretvorbi pa uporablja H₂ (prav tako odpadek na raketi) [11]. Bakterija lahko torej na osnovi odpadnih virov proizvede etanol in acetat, ki kvasovki predstavljata vir ogljika [6].

3 moduli sistema

Modul 1: sinteza hranil in okusa

Prvi modul sestavljajo biokocke:

Koda	Opis biokocke
BBa_K3570002	Konstitutivna sinteza β-karotena v kvasovki.
BBa_K3570000	Konstitutivna povečana sinteza geranilgeranil pirofosfata v kvasovki.
BBa_K3570001	Kvasovki da okus po sladki vrtnici.
BBa_K3570003	Kvasovki da okus po limoni.

Biokocka BBa_K3570002

Ekipa je v kvasovki želela proizvajati β-karoten, za kar sta potrebna 2 encima iz kvasovke Xanthophyllomyces dendrorhous: fitoen desaturaza (CrtI) in likopen ciklaza/fitoen sintaza (CrtYB). Encima katalizirata serijo reakcij, pri katerih iz geranilgeranil pirofosfata (GGPP) nastane β-karoten (slika sintezne poti) [6, 12]. Ker je CrtYB transmembranski protein, CrtI pa citosolni, so se odločili za fuzijo obeh encimov, s čimer je encimska pretvorba hitrejša [12].

Biokocka BBa_K3570000

β-karoten nastaja iz GGPP, zato se je ekipa odločila, da bo v kvasovki skušala povečati sintezo GGPP. To so želeli doseči s pomočjo 2 encimov: GGPP sintaze (CrtE) iz X. dendrorhous in krajše verzije 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktaze 1 (tHMG1) iz S. cerevisiae (slika obeh pretvorb) [6].

Biokocki BBa_K3570001 in BBa_K3570003

Izbiro okusa kvasovk bi ekipa prepustila astronavtom, zato so se odločili, da bo sinteza molekul, ki dajo okus, inducibilna s pomočjo optogenetike. Zaradi preprostosti so izbrali okusa po sladki vrtnici ter po limoni, saj obe molekuli za okus nastaneta iz geranil pirofosfata (prekuzor GGPP) z eno samo encimsko pretvorbo [6]. Za okus po sladki vrtnici sta potrebni 2 molekuli: geraniol, ki ima aromo vrtnice [13] in brazzein, ki je majhen polipeptid z izjemno sladkim okusom [14]. Geraniol nastane iz geranil pirofosfata z encimom geraniol sintaza iz Catharanthus roseus. Biokocka BBa_K3570001 je sestavljena tako, da vsebuje dvosmerni inducibilni promotor Gal1/10, tako da se v eno smer izrazi gen za geraniol sintazo, v drugo smer pa gen za brazzein. Preko restrikcijskih mest XbaI in BamHI se lahko vstavi ustrezno optogenetsko vezje [6]. Za okus po limoni je potrebna ena sama molekula: limonen, ki nastane iz geranil pirofosfata z encimom limonen sintaza. Biokocka BBa_K3570003 vsebuje gen za limonen sintazo pod dvosmernim inducibilnim promotorjem Gal1/10, vsebuje pa tudi restrikcijski mesti XbaI in BamHI za vnos optogenetskega vezja [6].

Modul 2: regulacija okusa preko optogenetike

Optogenetika temelji na uporabi proteinov, ki ob prisotnosti svetlobe točno določene valovne dolžine spremenijo konformacijo in s tem postanejo aktivni transkripcijski faktorji (TF) [15]. Ekipa si je zamislila, da bi lahko astronavti z izbiro modre ali rdeče svetlobe inducirali nastajanje molekul za okus v kvasovkah in tako spremenili okus prehranskega dopolnila. Odločili so se za uporabo modrega optogenetskega sistema EL222 in rdečega optogenetskega sistema PhyA/FHY1 [6]. Razvili so biokocki:

Koda	Opis biokocke
BBa_K3570005	Moder optogenetski sistem v kvasovki.
BBa_K3570004	Rdeč optogenetski sistem v kvasovki.

Moder optogenetski sistem temelji na uporabi TF EL222 iz bakterije Erythrobacter litoralis. Na modri svetlobi (450 nm) EL222 homodimerizira in izpostavi DNA-vezavno domeno, s katero se lahko veže na umetni promotor C120. V kvasovkah EL222 sam po sebi ne more delovati kot TF, zato je potrebna fuzija s proteinom VP16 (protein virusa herpes simplex, ki deluje kot TF) in jedrnim lokalizacijskim signalom (NLS) [16]. Sistem torej deluje tako, da modra svetloba inducira izražanje gena pod promotorjem C120.

Biokocka za moder optogenetski sistem vsebuje gen za NLS-EL222-VP16 pod konstitutivnim promotorjem ter gen za GFP pod dvosmernim inducibilnim promotorjem C120. Deli biokocke so namenjeni vnosu v biokocko za okus, in sicer se lahko promotor C120 preko restrikcijskih mest XmaI-SalI zamenja s promotorjem Gal1/10, preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI pa se lahko vstavi gen za NLS-EL222-VP16 skupaj s promotorjem in terminatorjem (slika levo spodaj). Ekipa je želela združiti moder optogenetski sistem z okusom po limoni, tako da bi kvasovke na modri svetlobi začele proizvajati limonen [6].

Rdeč optogenetski sistem deluje na podoben način kot moder (več informacij), le da je tu potreben promotor Gal1/10 [6]. Biokocka za rdeč optogenetski sistem vsebuje pod dvosmernim konstitutivnim promotorjem gena za fuzijska proteina, ki na rdeči svetlobi interagirata in tvorita aktiven transkripcijski faktor. Celotno biokocko lahko preko restrikcijskih mest XbaI-BamHI vstavimo v biokocko za okus (slika desno spodaj). Na tak način je ekipa želela združiti rdeč optogenetski sistem z okusom po sladki vrtnici [6].