Rapidemic razvoj novega kompleta za hitro diagnostiko na mestu oskrbe

Projekt RAPIDEMICS je projekt šudentov Univerze v Leidnu, Nizozemska. Ideja za projekt je bila ustvariti hitar diagnostični test za detekcijo novih patogenov.

Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:Leiden

Avtor povzetka: Mirsad Mešić

Uvod

Na začetku leta 2020 je Svetovna zdravstvena organizacija (WHO) le nekaj mesecev po odkritju koronarno virusne bolezni 2019 (COVID-19) le-to razglasila za pandemijo. Nadzor nad boleznijo bi lahko ponovno pridobili z zmanjšanim številom interakcij: socialna distanca, zapiranje in sledenje stikom. To ni samo prekinilo vsakdanjega življenja, ampak v nekaterih primerih ljudem onemogočilo pridobivanje zaslužka za preživljanje družine. Izolacija prebivalstva zaradi svoje resnosti ni dolgoročna rešitev Ta pandemija je pokazala pomembnost preskusne zmogljivosti, saj je izolacija okuženih posameznikov ključnega pomena za omejevanje širjenja bolezni med prebivalstvom. Omejena zmogljivost testiranja lahko povzroči premajhno diagnozo okuženih posameznikov, kar ustvari netočno oceno dejanskih okužb med izbruhom. To ogroža nadzor bolezni in lahko poglobi krivuljo. Dokler ni na voljo učinkovito cepivo ali zdravljenje, je edina rešitev testiranje. Krčenje gozdov hitro poveča stik med ljudmi in živalmi, kar ima za posledico lažji prenos zoonotskih patogenov. Globalno segrevanje vpliva na številčnost in razširjenost prenašalcev bolezni, ki so posledica spremenjenih okoljskih razmer.

Projekt RAPIDEMICS

Trenutni testi se niso izkazali za zadostne za obvladovanje izbruha. Obstajajo tri glavne kategorije diagnostičnih testov: testi ojačanja nukleinske kisline (PCR), testi na osnovi antigena in testi na protitelesa. Ti testi imajo svoje prednosti in slabosti. Velika pomanjkljivost preskusa pomnoževanja nukleinske kisline PCR so drage zahteve: termocikli, laboratoriji in usposobljeni operaterji. Po drugi strani se testi na antigenih razvijajo dolgo, medtem ko je hiter diagnostični odziv ključnega pomena. Tretjič, testov na protitelesa ni mogoče uporabiti v zgodnjih fazah okužbe, kar pomeni, da je mogoče doseči negativen rezultat, čeprav bi bila oseba že kužna. Cilj projekta je bil oblikovati test, ki je laboratorijsko neodvisen, hitro zagotavlja rezultate in ga je mogoče enostavno prilagoditi za testiranje na kakršen koli nov patogen. Metoda zaznavanja nukleinske kisline je sestavljena iz treh reakcij: Ojačanje rekombinazne polimeraze (RPA), linearno ojačanje premika verige (LSDA) in katalitična oksidacija z gvanin-kvadrupleksom (GQ). Za večino poskusov RPA je bila kot tarča pomnoževanja uporabljena izolirana genomska DNA Saccharomyces cerevisiae. Prav tako se reakcija izvaja na sintetičnih predlogah, pridobljenih iz: Bacillus subtilis, Plasmodium falciparum, Mycobacterium sp. in gripa A H1N1.

Rekombinazna amplifikacija polimeraze (RPA)

Ojačevanje rekombinazne polimeraze (RPA) je enocevna, izotermična alternativa verižni reakciji s polimerazo (PCR). Ker je izotermičen, lahko RPA uporablja veliko preprostejšo opremo kot PCR, za kar je potreben termični cikel. Najboljše delovanje pri temperaturah 37–42 ° C. Zaradi tega je RPA odličen kandidat za razvoj poceni, hitrih molekularnih testov na mestu oskrbe. Proces RPA uporablja tri jedrne encime - rekombinazo, enojno vezavni protein, ki veže DNA (SSB), in polimerazo, ki izpodriva verigo. Rekombinaze so sposobne seznaniti oligonukleotidne prajmere s homolognim zaporedjem v dupleksni DNA. SSB se veže na izpodrinjene verige DNK in prepreči, da bi se primerki premaknili. Končno, veriga, ki izpodriva polimerazo, začne sintezo DNA, kjer se je primer primerjal na ciljno DNA. Primarni pari, uporabljeni v tem poskusu, so bili zasnovani tako, da ciljajo na zaporedje 191 bp iz genoma Saccharomyces cerevisiae. Reverzni primerji imajo previs ~ 27 nukleotidov, ki vsebuje reverzno komplementarno zaporedje mesta prepoznavanja za nicking endonukleazo, kratek distančnik (manj kot 10 bp), in zaporedje, obratno komplementarno DNAzymu.

Ojačevanje linearnega premika verige (LSDA)

Če endonukleaza zavrže eno verigo tarče DNA, nastane primer za polimerazo, ki sproži sintezo. Med polimerizacijo se spodnji del verige premakne v enoverižno obliko, obenem pa se regenerira tudi nikirno mesto. Kombinirano neprekinjeno ponavljajoče se delovanje nikinga s pomočjo endonukleaze in sinteza izpodrivanja verige s polimerazo povzroči linearno ojačanje ene verige molekule DNA. V reakciji ojačanja z linearnim premikom verige (LSDA) nikaza naredi enostranski rez v dvoverižnem izdelku RPA 4. Nato polimeraza, ki izpodriva verigo, začne podaljšati 3 'konec DNA na mestu reza in sprosti zaporedje GQ iz produkta RPA.

GQ-katalizirana oksidacija

V reakciji oksidacije zaporedje enoverižne DNA tvori strukturo gvanin-kvadrupleks (GQ), stabilizirano s kalijevimi ioni in heminom. Ta struktura deluje posnemajoče peroksidazo; DNAcim lahko oksidira 3,3 ', 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) v prisotnosti vodikovega peroksida (H2O2), da povzroči spremembo barve.

Hardware

Zasnova prototipa je bila sestavljena iz 3x3 reakcij, ki so omogočale naknadno ojačanje in zaznavanje (1) testnega vzorca, (2) negativne kontrole in (3) pozitivne kontrole. Te reakcije so potekale v majhnih vdolbinicah s prostornino 20 µL za RPA, 10 µL za LSDA in 100 µL za barvno reakcijo. Reakcijske jamice so zaprte v svetlobno neprepustni škatli, da se prepreči kontaminacija reagentov in zaščiti svetlobno občutljiv substrat barvne reakcije (TMB) 1 pred razgradnjo. Prototip lahko uporabimo tako, da testni vzorec dodamo v jamico prve reakcije (RPA), čemur sledita dva cikla inkubacije in prenos v naslednjo reakcijo, dokler zadnja reakcija ne privede do rezultata kolorimetričnega testa. Skozi okno na vrhu lahko s prostim očesom opazimo spremembo barve. Skupni reakcijski čas je bil 70 minut, od tega 20 minut za prvo reakcijo (RPA), 40 minut za drugo reakcijo (LSDA) in 10 minut za barvno reakcijo. V sedanji zasnovi so domnevali, da je mogoče RPA in LSDA združiti v reakcijo z enim loncem. Njihov prototip naj bi imel dve glavni reakcijski komori, en dovod vzorca in dve komori za vmesno shranjevanje. Obe vmesni shrambi bosta povezani tudi z dvema dodatnima reakcijskima komorama, da se bosta lahko nastavili za pozitivno reakcijo nadzora.

Rezultati

DTT, ki je bil neizogibno prisoten v reakcijskih mešanicah RPA in LSDA, je bil opredeljen kot glavno reducirno sredstvo, ki je preprečevalo nastanek barv med naknadnimi reakcijami oksidacije TMB. Dodatni zapletenosti smo se izognili z izvajanjem sheme redčenja, ki omejuje koncentracijo DTT v končni reakciji oksidacije. Čeprav so integrirali tri reakcije, je tehnika predstavila pomembne lažno pozitivne signale v odsotnosti ciljne sekvence. Dodatek 2,5% DMSO v reakciji RPA je učinkovito zmanjšal pojav lažno pozitivnih signalov. Predvideni stroški Stroški reagenta so znašali 1,45 USD na reakcijo, od tega 1,30 USD za reakcijo RPA, 15 centov za reakcijo LSDA in 0,05 centa za barvno reakcijo. Stroški za endonukleazo so se že zmanjšali 40-krat z zmanjšanjem koncentracije encima in reakcijskega volumna LSDA. Prihodnje delo se lahko osredotoči na vključitev prvih dveh reakcij (RPA in LSDA) v reakcijo z enim loncem, kar bi zmanjšalo količino uporabljenega reagenta in skrajšalo dodaten čas za test.Parts

Parts

Sekvence treh DNAzyme delov.

Part:BBa_K1614007 http://parts.igem.org/Part:BBa_K1614007

Part:BBa_K3343001 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343001

Part:BBa_K3343000 http://parts.igem.org/Part:BBa_K3343000

Zaključek

Kljub potrebi po nadaljnji optimizaciji je predstavljena metoda zaznavanja zaporedja lahko hitro diagnostično orodje. Zaznavanje, ki temelji na RPA, mu omogoča, da ga lahko preusmeri na druga zaporedja DNA s preprostim spreminjanjem začetnikov, podobno kot pri razvoju testov na osnovi PCR. To omogoča hitro prilagajanje metode za ciljanje na novo nastajajoče bolezni. Predstavljena shema zaznavanja zaporedja je predstavila obetavno jakost kot hitro diagnostično orodje na mestu oskrbe, ki lahko prispeva k prihodnjim poskusom diagnoze, spremljanja in omejevanja širjenja nalezljive bolezni.

Viri

1. Brink, M. E. van den et al. “Rapidemic, a versatile and label-free DNAzyme-based platform for visual nucleic acid detection.” bioRxiv (2020): n. pag.

2. Zanoli, L. M. & Spoto, G. Isothermal amplification methods for the detection of nucleic acids in microfluidic devices. Biosensors 3, 18–43 (2013).