Pri nizkih temperaturah aktivna pululanaza tipa I iz metagenoma vročih vrelcev omogoča učinkovito klestenje in proizvodnjo odpornega škroba

Uvod

Škrob spada med rezervne rastlinske polisaharide in je sestavljen iz amiloze (15–30 %) ter amilopektina (70–85 %) [1-3]. Delček škroba, ki se v tankem črevesu ob delovanju prebavnih encimov ne razgradi in se ne absorbira, imenujemo odporni škrob (ang. resistant starch ali RS). RS delimo na osnovi oblike, izvora in lastnosti v pet skupin. Z retrogradacijo naravnega škroba lahko pridobimo RS3, ki ima negranularno strukturo in povečano kristaliničnost. Je tudi termično stabilen, poleg tega pa ima visoko hranilno vrednost in lastnosti prehranskih vlaknin, zato postaja vedno bolj uporaben v prehrambni industriji [1, 4].

Pululanaza je klestilni encim, ki ga, glede na katalitično specifičnost, delimo v dva tipa. Pululanaza tipa I lahko hidrolizira α-1,6-glikozidne vezi, kar ji omogoča pretvorbo amilopektina v škrobu v linearne polimere glukoze. To predstavlja prednost pri proizvodnji RS3, saj se hidrolizirani polimeri lažje in hitreje agregirajo oziroma kristalizirajo v odpornejšo obliko [1].

Odkritje gena in postopek priprave rekombinantnega encima

Znanstveniki so v metagenomu indijskega termalnega vrelca odkrili gen pulM, ki zapisuje pululanazo tipa I, in ga prenesli v vektor pET28a(+). Kompetentne E. coli BL21[DE3] so v nadaljevanju transformirali s tako pripravljenim plazmidom in z dodatkom IPTG inducirali izražanje encima. Pululanazo so iz celičnega lizata izolirali z Ni-afinitetno kromatografijo, očiščeno frakcijo pa analizirali s PAGE in tako določili čistost (95 %) ter molsko maso encima (približno 80 kDa) [1].

Analiza kinetičnih lastnosti encima

Hidrolitično aktivnost pululanaze PulM pri razgradnji substrata pululana so izmerili tako, da so s pomočjo reagenta DNS (dinitrosalicilna kislina) spremljali delež reducirajočih koncev v raztopini. Pululan je linearni polisaharid, zgrajen iz maltotrioznih podenot, povezanih z α-1,6-glikozidnimi vezmi, ki jih med inkubacijo PulM cepi [1,5].

V nadaljnjih poskusih so preverjali encimsko aktivnost in stabilnost pululanaze pri različnih temperaturah (4–80 °C) ter vrednostih pH (4,5–10), poleg tega so določali tudi vpliv kovinskih ionov in drugih kemikalij (detergentov in denaturantov) na katalitične lastnosti. Maksimalna katalitična aktivnost je bila opažena pri 40 °C in pH med 6 in 7. Encim je v alkalnem manj stabilen in ima manjšo katalitično aktivnost, pri nizkih vrednostih pH pa pululanaza popolnoma izgubi katalitično aktivnost. Pri 4 °C lahko PulM razgrajuje substrat s 50 % učinkovitostjo. Poskusi so pokazali tudi izjemno stabilnost encima pri optimalni temperaturi, saj se je aktivnost po štiridesetih dneh na 40 °C zmanjšala za samo 15 %. Ključno vlogo pri ohranjanju encimske aktivnosti ima Ca²⁺, ki stabilizira tridimenzionalno proteinsko strukturo. Dodatek detergentov in denaturantov ni ključno vplival na encimsko aktivnost, se je pa aktivnost povišala ob dodatku reducentov [1].