Renervate: Polimer za zdravljenje poškodb hrbtenjače

Renervate [1] je iGEM projekt iz leta 2020, katerega avtorji so skupina iz King's College London. Projekt je prejel prvo nagrado v kategoriji Terapevtki za podiplomske študente. Spletna stran projekta: https://2020.igem.org/Team:KCL_UK

Avtor povzetka: Sabina Sladič Oblak

UVOD

S poškodbami hrbtenjače se vsako leto po svetu srečuje od 250 000 do 500 000 ljudi, a kljub visokim številkam ni uspešnih regenerativnih zdravljenj. Zdravljenja, ki se izvajajo se osredotočajo na akutno fazo zdravljenja poškodb z npr. imobilizacijo ali kirurško kompresijo hrbtenice, nobene skrbi pa ni namenjene zdravljenju kronične faze v kateri glija celice tvorijo brazgotinsko tkivo. Poškodbe so zato večinoma nezdravljene, kar vodi prilagoditev posameznika na življenje s poškodbo.

NASTANEK POŠKODBE

Na mestu poškodbe pride paralize neoživčenega mišičevja in prekinitve dolgih živčnih traktov, ki vodijo v izgubo čutilnih in motoričnih funkcij. Okvarjeni aksoni nevronov ne morejo oživčevati tkiv pod nivojem nastale poškodbe in prenašati informacij iz tkiv nazaj v možgane. Rezultat tega je izguba funkcije različnih tkiv in organov [2]. Zaradi poškodbe živcev je en od simptomov pojav kronične bolečine.

Poškodbo hrbtenjače delimo v tri faze: akutna, subakutna in kronična faza. V prvih dveh fazah pride do mehanskih poškodb hrbtenjače, ki vodijo v kaskado bioloških dogodkov kot so spremembe krvno-žilnega sistema (krvavitev, uničenje krvno-možganske bariere, infiltracija inflamatornih celic), tvorba prostih radikalov in apoptoza nevronov. V kronični fazi (dneve do leta po poškodbi) pa lahko pride do nevroloških okvar, demielinizacije beline, razgradnje sivine in reaktivne glikoze.

Med reaktivno gliozo nastane glija brazgotina, ki vsebuje astrocite, celice mikroglije, fibroblaste in Schwannove celice. Barzgotina je tako fizična kot kemijska ovira ponovne rasti nevronov.

IDEJA

Za regeneracijo živčnih celic so v raziskavah biomateriali kot so hidrogeli in kanali za voden razrast živčnih celic (angl. Nerve guidance channel). Na osnovi idej ekip iz Leidna in Great SCIE je skupina iz King's College London dobila idejo za izdelavo kanala zasnovanega v obliki mostu, ki bo omogočil voden razrast aksonov nevronov na poškodovanem delu hrbtenjače. Natančneje, zasnovali so ogrodje iz poli-ɛ-kaprolaktona, prekrito z bioadhezivnim proteinom iz noge školjk. Tako bo biomaterial služil ne le mehanski opori, temveč tudi boljši adheziji aksonov za regeneracijo v ustrezni smeri.

OPIS PROJEKTA

Ta iGEM projekt je sestavljen iz dveh faz; izdelava ogrodja s pomočjo 3D-biotiskanja in sinteze z nadaljnjo polimerizacijo izbranega proteina Pvfp-5β z uporabo ko-ekspresijskega sistema v rekombinantnih celicah Escherichia coli BL21(DE3). Zaradi Covid-19 pa je skupina iz King's College London uspela izvesti le fazo I, a ogrodja še ni natisnila.

-FAZA I: IZDELAVA OGRODJA

Izdelava ogrodja (angl. scaffold) za uporabo pri zdravljenju poškodb hrbtenjače omogoča rekonstrukcijo arhitekture tkiva hrbtenjače, aksonom predstavlja vodilo za regeneracijo v pravilni smeri in onemogoča nastanek brazgotine na mestu poškodbe.

Prvotno je bila želja po izgradnji ogrodja iz mešanice sintetičnega polimera poli-ɛ-kaprolaktona (PCL) in naravnega polimera citozana, saj citozan predstavlja efektiven sistem dostave zdravil in bi omogočal lokalizirano ter kontrolirano sproščanje učinkovin. Kljub določenim pozitivnim lastnostim kot so biokompatibilnost, biorazgradljivost in netoksičnost, pa je problem v njegovi imunogenosti. Zato se je skupina odločila za izdelavo ogrodja le iz PCL. Poli-ɛ-kaprolakton je poceni polimer z odličnimi mehanskimi lastnostmi, je biokompatibilen, biorazgradljiv (čas razgradnje do 24 mesecev), povzroči minimalen imunski odziv in ni toksičen, poleg tega pa ima nizko tališče (okrog 60°C), zato se uporablja za 3D-biotiskanje.

Literatura nakazuje, da sta za izdelavo ogrodja ključnega pomena mikro- in makro-arhitektura. Mikroarhitektura se bolj osredotoča na topografijo materiala in ustreznost površine za adhezijo in razširjanje aksonov. Makroarhitektura pa vpliva na efektivnost ogrodja in omogoča 3D organizirano rast celic. Za prilagajanje velikosti por in poroznosti materiala so se študentje odločili izdelati program The Porosifier. V naslednjem koraku so se lotili izdelave še MATLAB programa, s katerim so izvedli stimulacijo biorazgradnje polimernega skeleta in vivo, saj niso mogli dostopat do laboratorijev. V načrtu pa je 3D-biotiskanje ogrodja.

Cilj je, da bi klinični rabi na podlagi CT ali MRI slikanja s pomočjo zgoraj navedenih orodij oblikovali presonaliziran konstrukt in ga z operacijo vstavili na mesto poškodbe hrbtenice.

PROTEINI IZ NOGE ŠKOLJK

Izdelava ogrodja ni dovolj za samo zdravljenje poškodb hrbtenjače, saj ne zagotavlja dovoljšne adhezije za podporo rasti aksonov. Skupina se je zato odločila dodati protein iz noge školjk (angl. Mussel foot proteins, MFP), ki v naravi služijo za adhezijo školjk na različne površine (vse od morskega dna do plastike in kovin). Dokazano pa pomaga pri regeneraciji aktinskih filamentov v nesmrtnih celičnih linijah ter predstavlja obetavno pomoč tudi pri razrasti aksonov. Adhezivi, trenutno uporabljeni v medicini onemogočajo adhezijo v vodnem okolju, zato so MFP-ji za uporabo zelo zanimivi.

Skupina KCL si je za kandidatni protein izbrala Pvfp-5β, pridobljen iz Azijske zelene školjke (Perna viridis). Pvfp-5β predstavlja ključno izoformo proteina iz noge školjk, potrebnega za adhezijo. Je biokompatibilen, netoksičen in je mehansko močen. Vsebuje visok delež iz tirozina modificiranih DOPA ostankov (3,4-dihidroksifenilalanin), ki tvorijo adhezijske vezi preko vodikovih in koordinacijskih vezi ter kompleksacije kovin. Hkrati se lahko nahaja v elongirani obliki, ki maksimizira DOPA interkacije s površino. Podobno kot ostali MFP-ji, tudi protein Pvfp-5β povzroča majhen imunski odziv, zato bi bilo potrebno poleg zdravljenja z Renervate uporabiti imunosupresivno terapijo. Za boljše razumevanje strukture in funkcije je skupina izdelala strukturni model proteina Pvfp-5β, nato pa so s programsko opremo YASARA zmanjšali razdalje med ostanki C86-C95 na 4.5 Å in pridobili željeni model z vsemi štirimi disulfidnimi vezmi.

-FAZA II: LABORATORIJSKO DELO

BIOKOCKE

Skupina se je odločila konstruirati ko-ekspresijski sistem ki omogoča in situ polimerizacijo željenega proteina Pvfp-5β. Genetsko orodje bodo z metodo transformacije vnesli v E. Coli BL21(DE3), ki bodo nato poleg proteina sintetizirale tudi encim tirokinazo. Pred tem bosta inserta proteina MFP in encima vstavljena v ločena plazmida in klonirana. Predvidena je uporaba dveh biokock in treh kompozitov. Prvi kompozit je uporabljen kot ogrodje za izdelavo dveh ločenih ekspresijskih vektorjev. Sestavljen je iz T7 promotorja, lac operatorja, RBS, 7x His- oznake, pBluescript II SK+ f1 orija in zapisa za ampicilinsko rezistenco. Histidinske oznake so dodane za lažje čiščenje proteina.

Pvfp-5β ekspresijski vektor (2755 bp) poleg naštetih biokock prvega kompozita vsebuje še zapis za Pvfp-5β, tirozinazni kompozit (3116 bp) pa še zapis za encim tirozinazo. Kot že omenjeno pričakujejo na paralelno izražanje obeh ekspresijskih vektorjev in nastanek polimera in vitro.

Ob zasnovi kompozitov je skupina posebno pozornost namenila potencialnim problemom kot je nizka kontrola transkripcije, majhen izkoristek po čiščenju in visoka toksičnost za gostiteljske celice, ter se jim z izbiro ustreznih biokock želela izogniti.

POTEK POLIMERIZACIJE Z ENCIMOM TIROZINAZA

Tirozinaza je polifenol oksidaza, najdena v številnih organizmih. Katalizira hidroksilacijo tirozinskih ostankov v DOPA, nato pa oksidacijo DOPA v DOPA-kvinon. Na podlagi literature je v načrtu polimerizacija proteina Pvfp-5β s tirozinazo, saj proteinov ne agregira in ne spremeni funkcije proteina. Tirozinaza-katalizirana polimerizacija je dvostopenjski proces, kjer se najprej iz cisteina in DOPA-kvinona tvorijo cisteinil-DOPA prečne povezave, nato pa se prečno povezujejo še nezreagirani DOPA-kvinoni, ki tvorijo 5-5' diDOPA. Za pridobitev adhezijskih lastnosti je DOPA-kvinon potrebno pretvoriti nazaj v DOPA. Skupina se je odločila za redukcijo iz DOPA-kvinona s pomočjo oksidanta natrijev askorbat.

Uporabili bodo tudi BCA (bicinhoninska kislina) test, s katerim bodo določali in merili količino polimeriziranega proteina, ki bo reduciral Cu2+ v Cu+ (v bazičnem mediju). Temu bo sledila detekcija nastanka Cu+ kationa s pomočjo bicinhoninske kisline (BCA).

V raztopino bioadhezivnega polimera bodo na koncu dodali iz PCL sintetizirano ogrodje in na ta način prišli do končnega konstrukta imenovanega Renervate.

TESTIRANJE USTREZNOSTI PROTEINA Pvfp-5β IN NADALJNJE DELO

V načrtu je izvedba validacije učinkovitosti modela in ocena adhezivnosti proteina s testi adhezije. V primeru potrebnega izboljšanja stabilnosti proteina in adhezije proteina bodo uporabili knjižnico fagov za izražanje proteina na njihovi površini. Pričakujejo tudi, da bodo z ustreznimi metodami opazovali razrast aksonov in vitro in na živalskih modelih. Testiranja bodo verjetno bolj obširna, a v projektu iGEM 2020 niso natančno navedena.

ZAKLJUČEK

Skupina je do sedaj s pomočjo in silico metod izvedla dobršen del projekta, ki pa ga bodo v letu 2021 nadaljevali z izdelavo 3D-tiskanega ogrodja in z laboratorijskim delom (Faza II). Z iGEM 2021 pričakujejo dokončno izdelavo konstrukta Renervate. Poleg začrtanih ciljev, pa že razmišljajo o izdelavi izboljšav. Verjamejo v potencial zdravljenja poškodb hrbtenjače s kombinacijo njihovega konstrukta in sistema dostave zdravil vstavljenega v ogrodje, kar bi omogočalo lokalno sproščanje učinkovin in učinkovitejše zdravljenje.

VIRI

[1] iGEM 2020 King’s College London, “Renervate,” 2020. https://2020.igem.org/Team:KCL_UK. [2] E. J. Bradbury and E. R. Burnside, “Moving beyond the glial scar for spinal cord repair,” Nat. Commun., vol. 10, no. 1, p. 3879, 2019, doi: 10.1038/s41467-019-11707-7.

DODATEK: Hiperpovezave do razširjenih tem Renervate, opisanih v povzetku, ki jih ni na zgornji povezavi

https://2020.igem.org/Team:KCL_UK/Design#top https://2020.igem.org/Team:KCL_UK/Contribution https://2020.igem.org/Team:KCL_UK/SCI_Pathophysiology