Mehanizem fuzije koronavirusne membrane kot tarča za protivirusna zdravila

Uvod

Protein S je najpomembnejša tarča zdravil in cepiv proti koronavirusom. Na njem najdemo dve pomembnejši tarči za zdravila, in sicer regijo, ki se veže na receptor in regijo, ki je odgovorna za zlitje z membrano. Regija proteina S, ki je odgovorna za vezavo na receptor, je zelo slabo ohranjena med različnimi koronavirusi in zato ni najbolj primerna tarča za zdravila, ki imajo širok spekter delovanja na več koronavirusov. Medtem pa je regija, ki je odgovorna za zlitje z membrano, med najbolj ohranjenimi regijami koronavirusov, in tako primerna tarča za zdravila, ki imajo širši spekter delovanja na več koronavirusov. V nadaljevanju se bomo osredotočili na razvoj antifusogenih zdravil in njihovih proteinskih tarč.

Proteolitska aktivacija koronavirusov

Koronavirusi lahko v celico vstopijo na dva načina, kadar so prisotne membranske proteaze virus lahko vstopi, tako da se zlije s celično membrano, v kolikor membranske proteaze niso prisotne virus vstopi s pomočjo endocitoze in se šele v notranjosti celice zlije z endocitotsko membrano. Za zlitje koronavirusa s celično membrano je potrebna prisotnost različnih proteaz, ki cepijo protein S in tako omogočijo vstop virusa v celico. Študije so pokazale, da se ob prisotnosti eksogenih proteaz, kot so tripsin, termolizin in elastaze, infektivnost SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 poveča. Ugotovitev, da elastaza poveča infektivnost, bi lahko imela klinični pomen, saj elastazo med okužbo s SARS-CoV proizvajajo vnetne celice v pljučih, kar bi lahko spodbudilo okužbo pljučnih celic z virusom. V fizioloških pogojih imajo pomembnejšo vlogo transmembranske proteaze, saj mora cepitev na koronavirusu poteči šele potem, ko se virus veže na receptor, kar pri eksogenih proteazah težje kontroliramo kot pri transmembranskih. Pri vstopu koronavirusa v celico sodelujejo predvsem transmembranske serinske proteaze tipa II. Inhibitorji transmembranskih proteaz bi lahko bili potencialno zdravilo, ki bi zmanjšalo infekcijo celic z virusom, saj se ta ne bi mogel zliti z membrano.

Če ustrezne proteaze niso prisotne lahko virus v celico vstopi s pomočjo endocitoze, ki je lahko odvisna ali neodvisna od klatrina. Pri MERS-CoV pa pride do vstopa z endocitozo, tudi kadar ta ni bil cepljen na mestih S1/S2 med samo biosintezo ne glede na prisotnost proteaz. Za takšen način vstopa koronavirusa v celico je potreben nizek pH, ki aktivira katepsina B in L, ki proteolitsko aktivirata virus, da se ta lahko zlije z membrano endosoma in njegov virion vstopi v citosol. Študije so pokazale, da inhibitorji katepsinov pri okužbah s SARS-CoV in MERS-CoV zmanjšajo njihovo zmožnost vstopa v celico.

Torej SARS-CoV, MERS-CoV in SARS-CoV-2 lahko v celico vstopijo na dva načina. V kolikor so na celični membrani prisotne TMPRS22 proteaze pride do fuzije virusa s celično membrano, v primeru MERS-CoV je zato potrebna tudi predhodna cepitev na mestih S1/S2. Če ti pogoji niso izpolnjeni, bo virus v celico vstopil z endocitozo, in se ob znižanju pH ter posledični aktivaciji katepsinov zlil z membrano citosola in tako vstopil v citosol. Neposredna fuzija koronavirusa s celično membrano pa je tudi ugodnejši način vstopa za virusa, saj se njegov dedni material zlije direktno v citosol. Tak način vstopa v celico pa je tudi klinično pomembnejši.

Membranska fuzija

Fuzija membran je termodinamsko gledano ugoden proces, vendar je prvi korak približevanja membran energijsko zelo zahteven Vloga virusnih fuzijskih proteinov je kataliza in prispevanje energije za reakcijo približevanja. Koronavirusni fuzijski proteini sodijo v prvi razred fuzijskih proteinov, kamor jih uvrščamo zaradi strukture, potrebe po aktivaciji s proteolitično cepitvijo ter delovanja s heptadnimi ponovitvami (HR1/2). Med delovanjem proteinov prvega razreda preidejo proteini čez več oblik: predfuzijska nativna oblika, predfuzijska metastabilna oblika, predlasnična oblika in postfuzijska stabilna oblika. Po sintezi se protein S nahaja v predfuzijski nativni obliki, v matestabilno obliko pa preide ob cepitvi na mestu S1/S2. S prehodom iz metastabilnega v predlasnično obliko protein premaga kinetično bariero. Energijo za ta dogodek dobi protein preko interakcije s sprožilcem iz okolja, pri koronavirusih so ta sprožilec proteaze. Interakcija s sprožilcem povzroči ireverzibilne konformacijske spremembe proteina, ki mu omogočijo vstavitev fuzijskega peptida (FP) v tarčno membrano. Vstavitvi FP sledi sestavljanje HR1 v trimer nato pa se nanj vežejo še trije peptidi HR2, kar tvori t.i. fuzijsko jedro. Konformacijske spremembe tega kompleksa povlečejo obe membrani bližje skupaj, tako da se lahko fuzija začne, fuzijski protein pa preide v postfuzijsko stabilno obliko. Sama fuzija je sestavljena iz dveh korakov: prvo nastane hemifuzijska tvorba in nato pora. Hemifuzijska tvorba je stanje, kjer sta se zlili le zunanji membrani, notranji membrani pa sta še ločeni, tako da citosol in notranjost virusa še nista povezana. Hemifuzijsko stanje lahko razpade nazaj na virus in celico, ali pa se zlijeta še notranji membrani in dobimo poro, ki se lahko še razširi.

Vloga holesterola pri fuziji

Za fuzijo so najbolj dovzetni lipidni splavi, saj se na njih klasično nahaja veliko proteinov in receptorjev, ki lajšajo fuzijo membran. Raziskave na različnih virusih kažejo, da je holesterol zelo pomemben za uspešnost fuzije virusa s tarčo. Poleg vloge pri vzpostavitvi tarč (lipidnih splavov),holesterol fuzijo membran olajšuje tudi mehanistično, saj znižuje potrebno energijo za nastanek fuzijskih intermediatov. Razumevanje vpliva holesterola na delovanje koronavirusov je dokaj omejeno, največ raziskav pa je bilo narejenih na SARS-CoV. Vsi razlogi niso bili natančno določeni, ugotovili pa so, da je holesterol definitivno pomemben za uspešnost fuzije tudi pri koronavirusih. Virus je bil namreč pri celicah, tretiranih z metil-β-ciklodekstrinom, spojino, ki zmanjša koncentracijo holesterola, 60-90 % manj uspešen. V prihodnosti nameravajo enak poskus izvesti še z SARS-CoV-2 in MERS-CoV, vendar pa bo treba pri MERS-CoV predhodno ugotoviti, ali se njegov tarčni receptor sploh nahaja v lipidnih splavih.

Vloga kalcija pri fuziji

Poleg pH in prisotnosti različnih proteaz se je za veliko virusov kot zelo pomembna izkazala tudi koncentracija Ca²⁺ ionov, ki je ne morejo nadomestiti primerljive koncentracije drugih 2+ ionov. S poskusi na SARS-CoV in MERS-Cov so najprej ugotovili, da je Ca²⁺ pomemben za uspešnost fuzije, z biofizikalnimi metodami pa še kakšna je interakcija Ca2+ pri fuziji. Ca²⁺ ioni stabilizirajo FP in pomagajo pri za fuzijo ugodnem urejanju membrane. Obstajajo pa večje razlike med interakcijami pri MERS-CoV in SARS-CoV. Ca²⁺ je namreč bolj pomemben za SARS-CoV, saj je odsotnost kalcija v primerjavi z MERS-CoV bolj prizadela SARS-CoV infektivnost, kar bi bila lahko posledica tega, da SARS-CoV-FP veže dva Ca²⁺ iona, enega na FP1 in drugega na FP2, MERS-CoV-FP pa ima le eno vezavno mesto na FP1.

Antifusogene učinkovine proti SARS-CoV

V procesu fuzije virusne membrane z gostiteljsko membrano imata pomembno vlogo peptida HR1 in HR2, ki sodelujeta pri formaciji pore med virusno in gostiteljsko membrano. Zaradi tega sta ta peptida pomembni tarči antifusogenih antiviretikov. Prva odkrita in potrjena za uporabo kot zdravilna učinkovina (ZU) z antifusogenim učinkom je bila enfuvirtid (uporabljana kot zdravilo proti HIV). Ta zdravilna učinkovina je HR2 peptid (prvotno z imenom DP-178), ki se kompetitivno veže na HR1 peptid in tako prepreči njegovo povezavo s HR2 in zavre fuzijo membran. Nadaljnje raziskave so pokazale, da so HR2 zelo specifični za HR2 vezavno zaporedje na HR1 peptidu in tako tudi specifični za posamezni virus – enfuvirtid je uporaben le proti virusu HIV-1, ne pa tudi proti HIV-2.

Poravnava zaporedij HR1 in HR2 regij med SARS-CoV in SARS-CoV-2 pokaže 92,6 % in 100 % homolognost iz česar lahko sklepamo, da bo uporaba SARS-CoV HR2 peptidov učinkovita tudi v primeru SARS-CoV-2. Podobno velja za MERS-CoV, ki pa nima visoke stopnje homolognosti in tako peptidi proti SARS-CoV v tem primeru niso uporabni. Več dejavnikov vpliva na učinkovitost in uporabnost teh peptidov:

· Razlike v aminokislinskih (AK) ostankih na vezavnem mestu HR1 za peptid: MERS-CoV s peptidom tvori več vodikovih vezi kot SARS-CoV in ima tako večjo afiniteto vezave.

· Prevladujoč način infekcije gostiteljskih celic: za MERS-CoV je prevladujoč način skozi plazemsko membrano, za SARS-CoV je bolj značilna endosomalna pot. Peptidi so bolj na voljo v ekstracelularnem prostoru in tako lažje dostopajo do svojih tarč v primeru, ko virus prehaja v celico skozi plazemsko membrano in ne endosomalno. Podoben vpliv ima obdelava SARS-CoV s tripsinom, ki povzroči, da virus spremeni svoj način vstopa v celice.

· Mutacije določenih AK ostankov: dodatek negativno in pozitivno nabitih ostankov (kot sta glutamat in lizin) vodi do nastanka solnih mostičkov in izboljšanje stabilnosti, topnosti in antivirusne aktivnosti peptida. Prav tako se zniža IC50.

· Konjugacija na monoklonsko protitelo, ki povečuje specifičnost vezave peptida z vezavnim mestom na virusu;

· Konjugacija s palmitatom: CoV receptorji se delijo v lipidno-bogate domene, kjer pride do vstopa CoV, palmitat povzroča delitev v lipidne splave in tako usmerja peptide proti lipidno-bogatim domenam.

Odkrite so bile tudi tarče za antifusogene peptide izven HR področij. Te tarče se nahajajo v okolici delitvenih mest S1/S2 in S2' in preprečujejo konformacijske spremembe potrebne za fuzijo. Pomemben del raziskovanja novih ZU je tudi na področju že odobrenih učinkovin, ki pa še nimajo določene uporabnosti za zdravljenje okužbe s SARS-CoV-2 (t.i. 'repurposing'). Ena izmed teh ZU je imatinib, prvotno uporabljena pri zdravljenju kronične mieloične levkemije, nato pa tudi proti Ebola virusu, coxsackie virusu in vakcinija virusu. Predvidevajo, da imatinib preprečuje ključne prerazporeditve citoskeleta v virusu, ki sodelujejo pri fuziji.

Viri in literatura

· Tang T, Bidon M, Jaimes JA, Whittaker GR, Daniel S. Coronavirus membrane fusion mechanism offers a potential target for antiviral development. Antiviral Res. 2020;178:104792. doi:10.1016/j.antiviral.2020.104792

· H. P. Rang, J. M. Ritter, R. J. Flower, G. Henderson: Rang and Dale's Pharmacology. Eighth edition. Elsevier Churchill Livingstone 2016, pp. 642-651, 676-691.

· Harrison SC. Viral membrane fusion. Virology. 2015;479-480:498-507. doi:10.1016/j.virol.2015.03.043