Integracija transpozonov pri kvasovkah

UVOD

Transpozicijske elemente najdemo pri mnogih evkariontih, med drugim tudi pri kvasovkah. Slednje uvrščamo v tako imenovano Ty družino retrotranspozonov, ki so strukturno in funkcionalno precej podobni retrovirusom. Takšnih transpozicijskih elementov poznamo pet, in sicer Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 in Ty5. Ker kvasovke vsebujejo precejšen delež kodirajočih zaporedij v svojem genomu v primerjavi z deležem intronskih regij, so se morali razviti posebni mehanizmi integracije, omenjenih Ty transpozonov na gensko revnejše predele, s čimer je normalna transkripcija ostalih genov čim manj ogrožena.

Specifična integracija je tako odvisna od kompleksnih interakcij med transpozoni in gostiteljsko celico, na točno določena mesta, ki so pri večini Ty transpozonov regije z zapisi za gene, ki jih prepisuje RNA polimeraza III. Izstopa le transpozicijski element Ty5, ki se za razliko od ostalih integrira v utišane predele kromatina specifičnih HM paritvenih tipov in telomerne regije. Ker so to zopet gensko revnejši predeli oz. predeli z mnogimi ponovitvami zaporedja, normalno delovanje in opravljanje funkcij organizma zaradi integracije ni ogroženo. Težava bi torej lahko nastopila v primeru Ty1, Ty2, Ty3 in Ty4, saj se vsi preferenčno integrirajo v podobne predele genoma, in sicer v bližino istih genov. Ta problem je rešen tako, da se vsak transpozon veže na svoje specifično mesto, kar vidimo na primeru Ty3. Pri Ty1, Ty2 in Ty4 pa je integracija usklajena s porazdelitvijo več endogenih kopij takšnih genov v genomu.

Integracija poteka preko transpozonom lastnih integraz, ki specifično interagirajo s povezovalnimi faktorji gostiteljske celice – največkrat so to DNA-vezavni proteini na ustreznih mestih. Zaenkrat smo pri kvasovkah uspeli takšne faktorje natančno identificirati le za Ty1, Ty3 in Ty5. Od načina integracije sta odvisna uspešnost in obseg transkripcije takšnih integriranih regij. Najbolj uspešna integracija naj bi bila pri Ty1 in Ty2, zato sta v celici prisotna v največjem številu. Kljub temu se mora v celici ohranjati relativno nizko število kopij, kar je zagotovljeno z regulacijo procesov aktivacije in zatiranja izražanja. Preveliko število kopij v celici bi negativno vplivalo na normalno delovanje celice in organizma v celoti.

Integracija pri transpozonu Ty5 poteče ob povezavi tarčne domene njegove integraze s proteinom Sir4 (protein heterokromatina). Ta povezava je pogoj za uspešno integracijo. Pri eksperimentu načrtne prekinitve interakcije se je namreč Ty5 integriral na poljubno mesto v genomu, kar bi lahko povzročilo mutagene spremembe. Prav tako vezava omenjenega transpozona na heterokromatin zavre transkripcijo ostalih de novo integriranih Ty5, s čimer je hkrati regulirano tudi ohranjanje ustreznega števila transpozonov Ty5 v celici. Ty1 in Ty3 interagirata z različnimi transkripcijskimi faktorji RNA polimeraze III. Takšen je v prvi vrsti TFIIIC, ki prepozna škatlo A, škatlo B in transkripcijski faktor TFIIIB. Slednji se veže na promotorsko mesto – TATA škatlo. Torej za integracijo tako Ty1, kot tudi Ty3 je potreben TFIIIC, nato pa pri obeh transpozonih sledi specifična interakcija še z drugimi enotami transkripcijskega sistema. Pri integraciji Ty1 sledi interakcija z AC40 podenoto RNA polimeraze III, pri Ty3 pa TFIIIC omogoči vzpostavitev povezave med IN3 (integraza transpozona Ty3) in dvema oz. tremi podenotami faktorja TFIIIB. Slednji ostane vezan skozi celotno transkripcijo genov, kar omogoča, da se Ty3 vključi v DNA na katerikoli stopnji transkripcije. Faktor TFIIIB se lahko poveže tudi s RNA polimerazo III. Zaradi omenjene interakcije, lahko polimeraza III vpliva na interakcijo med TFIIIB in IN3 in posledično na integracijo Ty3. Zaradi podobnosti med IN3 in RNA polimerazo III, lahko slednja zavzame vezavno mesto na TFIIIB, kar onemogoči vezavo IN3.

Ty1 pa za razliko od Ty3 za integracijo potrebuje prisotnost polimeraze III. Podenota polimeraze AC40, s katero interagira Ty1, se nahaja na površini RNA polimeraze III in je blizu dela DNA, ki je navzgor od vezavnega mesta za TFIIIB, torej blizu mesta, kamor se integrira Ty1. Ob zamenjavi AC40 podenote z njenim ortologom – AC40s se je Ty1 namesto na običajno mesto preferenčno integriral v subtelomerne regije genoma, kjer se pri kvasovkah nahajajo geni za odziv na spremembe v okolju. Takšna integracija bi lahko imela vpliv na odziv kvasovk na stresne pogoje. Do podobnih interakcij s podenoto AC40 RNA polimeraze III naj bi prišlo tudi v primeru Ty2 in Ty4, kar kaže na izredno pomembnost AC40 podenote za preživetje kvasovk.

ALI JE AC40 EDINA PODENOTA POLIMERAZE III, KI SODELUJE PRI VKLJUČEVANJU TY1 V DNA KVASOVKE?

Ko so z masno spektrometrijo raziskovali mesta na genomu, na katera se veže integraza Ty1 (IN1), so odkrili, da se veže na tista mesta, ki jih navadno zasedeta polimerazi (Pol I in Pol III). IN1 niso zaznali nikjer drugje na genomu, zato so sklepali, da je za vgrajevanje Ty1 v DNA potrebna samo prisotnost podenote AC40. Do podobnega odkritja so prišli, ko so raziskovali mesta vezave integraze Ty5. Potrdili so, da je vezava encima na podenoto AC40 dovolj, da se transpozon približa molekuli DNA in posledično vanjo vgradi. Kasneje so odkrili, da IN1 ne interagira le z AC40, ampak še s štirimi drugimi podenotami RNA polimeraze III (C25, C31, C34 in C53), s katerimi tvori šibkejšo povezavo. Podenote C31, C34 in C53, ki in vitro interagirajo z IN1 so postavljene tako, da sodelujejo pri specifični integraciji Ty1. Študije navzkrižnega povezovanja DNA-protein in krio-EM strukture so pokazale, da tudi podenota C34 interagira s faktorjem TFIIIB. Mutanti podenot C31, C34 in C53, ki so občutljivi na temperaturo, zmanjšajo frekvenco integracije Ty1. Te podenote lahko kljub šibki interakciji z IN1 spremenijo konformacijo RNA polimeraze III, s čimer vplivajo na interakcijo AC40-IN1 in druge korake integracije Ty1. Na mutantu C53 so izvedli še dodatne raziskave, in sicer so odkrili, da mutant C53 ∆2-280 povzroči popolno izgubo integracije Ty1 elementov navzgor od endogene tDNA, vseeno pa ni prišlo do preusmeritve integracije na področje subtelomer, kot je to značilno za mutante s prekinjeno interakcijo AC40-IN1. Do sedaj je bila večina raziskav o vlogi podenot polimeraze pri integraciji izvedena in vitro. Zato še ni točno znano, kako ostale podenote, poleg AC40 vplivajo na integracijo transpozonov in vivo. Za natančno vlogo in mehanizem delovanja podenot C31, C34 in C53 pri integraciji bi bilo zato potrebno izvesti še nadaljnje analize struktur in vivo.

Predintegracijski kompleks - intasom

Struktura IN/cDNA predintegracijskega kompleksa je bila do zdaj opisana že za več retrovirusov. Kompleks je zgrajen iz štirih integraz (dve zunanji in dve notranji), ki so vezane na eno molekulo cDNA. Te integraze se med seboj razlikujejo po zgradbi in po vlogi v kompleksu. Struktura intasoma Ty1 še ni točno določena, znano pa je, da so na cDNA transpozona Ty1 vezane vsaj 4 integraze, ki tvorijo interakcije z različnimi podenotami RNNA polimeraze III. Povezava med IN1 s podenotama C34 in C53 je najdena le pri RNA polimerazi III, saj sta ti podenoti specifični za to polimerazo. Dokazano je tudi, da je za tvorbo te interakcije potrebna predhodna tvorba vezi IN1-AC40.

Transport predintegracijskega kompleksa v jedro: Retroelementi za zaključek svojega cikla replikacije potujejo v in iz jedra. Jedrna ovojnica tako predstavlja fizično oviro, ki jo morajo prečkati, da uspešno zaključijo integracijo. Pri tem imajo ključno vlogo jedrni porni kompleksi, ki kontrolirajo prehajanje snovi. Jedrni lokalizacijski signal, ki sproži vstop predintegracijskega kompleksa v jedro, je bil najden na C-končni regiji Ty1 in Ty3. Jedrni lokalizacijski signal je pri obeh dvodelen in sestavljen iz nenavadno dolgega linkerja (29 aminokislin, običajno jih je 9-12), katerega fleksibilnost igra pomembno vlogo pri delovanju celotnega kompleksa. Ob vezavi importina α pride do konformacijske spremembe, pri čemer se izpostavi tarčna domena TD1. Ta se nahaja na linkerju in igra pomembno vlogo pri integraciji Ty1 v gostiteljsko DNA. Po vstopu predintegracijskega kompleksa v jedro, pride do odcepa importina α in vezave tarčne domene TD1 na domeno AC40, čemur sledi integracija Ty1 v izbrano regijo na gostiteljski DNA.

VLOGA STRUKTURE KROMATINA NA INTEGRACIJO Ty

Ty retrotranspozon daje pri integraciji prednost konfiguracijam kromatina, v katere jih privabijo povezovalni faktorji. Ty5 in Ty3 se prednostno integrirata v heterokromatinske in evkromatinske regije, ki niso del nukleosomov, Ty1 pa se integrira v nukleosome. Ravno ta razlika med Ty3 in Ty1 je razlog, da ne pride do prekrivanja njunih integracijskih regij. Pri obeh se te nahajajo na genih, ki jih prepisuje RNA polimeraza III. Integracija Ty1 navzgor od regij tDNA se ponovi na vsakih 70 bp, kar pomeni, da se v povprečju na en nukleosom integrirata dva Ty1. Primerjava teh mest integracije s položajem DNA v nukleosomu kaže, da se obe mesti nahajata na isti strani nukleosoma, blizu stičišča histonskih regij H2A in H2B. Prednost tega mesta za integracijo Ty1 se najverjetneje skriva v nižji energijski barieri.

Če podrobneje pregledamo integracijske profile Ty1, Ty3 in Ty5 lahko opazimo, da se ti v celoti ne ujemajo z legami njihovih povezovalnih faktorjev. Npr. nekatere regije, na katere se preferenčno integrira Ty5, se ne pokrivajo z vezavnim mestom za Sir4. Podoben primer je prisotnost AC40 in TFIIIB na večini regij tDNA, vendar je integracija Ty1 in Ty3 na le-te različno učinkovita. Po pregledu učinkovitosti integracije Ty3 na različnih regijah tDNA so opazili, da bi lahko bil eden od odločilnih faktorjev zvitost DNA, zaradi katere pride do motenj pri integraciji. Opazili so tudi, da se integracijsko mesto Ty1 prekriva z regijami prekomerne ekspresije proteina Sir3, visoke stopnje fosforiliranih H2A (γH2A) in nizke stopnje trimetiliranega histona H3 K79. γH2A je prisoten tudi pri tDNA, ki je prednostna tarča Ty1. Mnoge študije namigujejo, da fosforilacija H2A vpliva na sposobnost zmanjšanja stabilnosti nukleosomov tako, da privede do konformacijske spremembe dvojne vijačnice DNA, ki postane bolj dostopna drugim faktorjem. Prisotnost γH2A tako olajša integracijo Ty1. Identificiranih je več genov s funkcijami, ki vplivajo na preoblikovanje kromatina in tako uravnavajo učinkovitost integracije retrotranspozona Ty1. Izmed teh so le pri genu rad6∆ opazili precejšnjo spremembo v frekvenci integracije Ty1, ne da bi pri tem prišlo do spremembe celotnega integracijskega profila. Vendar so na tem področju potrebne še dodatne raziskave.

Na integracijo Ty1 bi lahko vplivale tudi druge strukturne značilnosti kromatina. Geni, ki jih prepisuje RNA polimeraza III, so bili opisani kot vezavna mesta za kohezin. Ta vpliva na kompaktnost kromatina, sodeluje pri nastajanju kromosomskih zank in združuje sestrske kromatide med fazama G2 in M celičnega cikla. Opaženo je bilo, da prisotnost mutantov kohezina ali Esp1, ki vplivajo na odstranitev kohezinskega kompleksa, negativno vplivajo na pogostost integracije Ty1. To nakazuje na to, da se Ty1 raje integrira med anafazo faze M, ko so kohezini odsotni.

VIRI

1.Bonnet, A., Lesage, P. Light and shadow on the mechanisms of integration site selection in yeast Ty retrotransposon families. Curr Genet 67, 347–357 (2021). https://doi.org/10.1007/s00294-021-01154-7

2.Lesage, P., & Todeschini, A. L. (2005). Happy together: the life and times of Ty retrotransposons and their hosts. Cytogenetic and Genome Research, 110(1-4), 70–90. doi:10.1159/000084940

3.Sultana, T., Zamborlini, A., Cristofari, G. et al. Integration site selection by retroviruses and transposable elements in eukaryotes. Nat Rev Genet 18, 292–308 (2017). https://doi.org/10.1038/nrg.2017.7

4. Cheung, S., Ma, L., Chan, P. H., Hu, H. L., Mayor, T., Chen, H. T., & Measday, V. (2016). Ty1 Integrase Interacts with RNA Polymerase III-specific Subcomplexes to Promote Insertion of Ty1 Elements Upstream of Polymerase (Pol) III-transcribed Genes. The Journal of biological chemistry, 291(12), 6396–6411. https://doi.org/10.1074/jbc.M115.686840