Funkcije nekodirajoče RNA, ki je po izvoru transpozonska

Uvod

Transpozicijski elementi (TE) predstavljajo pomemben dejavnik genomske kompleksnosti evkariontov. Pomembni so zaradi funkcije premikanja po DNA, ki pomembno vpliva na evolucijsko ločevanje organizmov, kratkoročno pa lahko predstavlja genomsko nestabilnost. Vplivajo tudi na aktivnost transkripcije genov v njihovi bližini s spreminjanjem njihovih epigenetskih značilnosti ali položaja regulatornih elementov.

V našem seminarju se bomo osredotočili na TE, ki predstavljajo izvor funkcionalnih dolgih ali kratkih nekodirajočih RNA pri rastlinah. Njihova funkcija je povezana s trans regulacijo aktivnosti genov na transkripcijskem in post-transkripcijskem nivoju. Trans regulacija je delovanje molekul na oddaljene dele genoma preko drugih, vmesnih molekul. Dolge nekodirajoče RNA iz TE spreminjajo izražanje genov z vezavo na proteine, razgrajevanjem majhnih RNA in tvorbo dupleksov z DNA ali RNA.

TE se lahko nahajajo v nekodirajočih delih DNA, kjer običajno nimajo večjega učinka, ali pa v neposredni bližini genov. Slednji močno vplivajo na nivo transkripcije bližnjih genov. Poleg tega lahko TE vplivajo na epigenetske značilnosti bližnjih regij DNA in tako dodatno vplivajo na izražanje genov. Zato so rastline razvile številne mehanizme za zmanjševanje vpliva TE na ali v bližini genov in omejitev traspozicijskih premikov na ta mesta.

TE so pomemben izvor nekodirajočih RNA. Pri rastlinah so to predvsem dolge in kratke nekodirajoče RNA (lncRNA, smRNA), ki predstavljajo glavni regulator izražanja genov. lncRNA molekule večinoma nastanejo s pomočjo encima RNA polimeraza II (RNAPII) alternativno pa z rastlinsko specifičnimi polimerazami (RNAPIV, RNAPV). lncRNA molekule z interakcijami s proteini, DNA ali RNA utišajo izražanje genov na nivoju transkripcije. Druga možnost je, da lncRNA prepoznajo specifičen DICER protein, ki tvori več smRNA, ki sodelujejo pri utišanju genov.

Aktivne majhne RNA, ki so po izvoru transpozonske

Po izvoru transpozonske male interferenčne RNA (siRNA), ki povzročijo metilacijo DNA in nastanek heterokromatina na mestih TE ter utišajo njihovo transkripcijo (het-siRNA)

V normalnih pogojih je večina TE utišanih z metilacijo. Mehanizem metilacije je od RNA odvisna DNA metilacija (RdDM). Začne se, ko od RNA odvisna RNA polimeraza 2 (RDR2) prepozna na novo nastale RNA iz TE, nastale z delovanjem encima RNAPIV in jih spremni v dsRNA molekule. Protein DICER - LIKE 3 (DCL3) jih nato procesira v 24 nt siRNA, prenese v citoplazmo in naloži na ARGONAUTE4 (AGO4) ali na AGO3 in AGO6 proteine. AGO4 s siRNA molekulami se vrne v jedro, tam prepozna RNAPV transkripte s komplementarnim zaporedjem. Po interakciji teh dveh RNA zaporedij se na kompleks veže posebna DNA metiltransferaza (DOMAINS REARRANGED METHYTRANSFERASE 2, DRM2). Ta povzroči metilacijo TE, iz katerih te RNA izvirajo. Posledica tega je kondenzacija kromatina in trajno utišanje TE. Pri utišanju sodeluje tudi DNA topoizomeraza 1α, encim, ki spreminja topologijo DNA. V tem procesu olajša tvorbo lncRNA molekul z RNAPV, približanje in vezavo AGO4 ter metilacijo H3K9 (H3K9me2). To nakazuje, da tudi organizacija DNA vpliva na utišanje TE. Ta mehanizem utišanja je za rastline pomemben kot odgovor na stres in za prenos epigenetskih informacij na potomce. Večkrat se zgodi, da se TE vrine v ali v bližino gena. Če na te TE deluje RdDM, se poleg TE metilirajo tudi ti geni. Metilacija po navadi predstavlja utišanje genov, zato lahko predstavlja težavo pri preživetju rastline.

Het-siRNA lahko delujejo trans. Pri Arabidopsis thaliana se v normalnih pogojih sintetizirajo het-siRNA molekule iz pericentromernih TE. Te prepoznajo in utišajo oddaljene gene za proteine, ki ob okužbi prepoznajo molekule pogosto prisotne v patogenih (PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, PRRs) in proteine vnetnega odziva ter prirojenega imunskega odziva (NUCLEOTIDE-BINDING LEUCIN-RICH REPEAT PROTEINS, NLRs). Ob okužbi s Pseudomonas syringae (Gram negativna bakterija), pride najprej do povišanega izražanja pericentromernih TE. Sledi RdDM, poveazana z akumulacijo het-siRNA, ki metilacijo usmerjajo na izvorne TE. To povzroči zmanjšanje represije obrambnih genov in večjo odpornost na patogen.

Epigenetsko aktivne siRNA (easiRNA), ki izvirajo iz TE in delujejo trans

Pri Arabidopsis je večina TE epigenetsko utišanih s 24 nt het-siRNA. Aktivacija prepisovanja utišanih TE se odraža v nastanku 21-22 nt easiRNA. Pri tem 21 nt miRNA, ki je naložena na AGO1, sproži cepitev TE prepisa, kar omogoči združitev kompleksa RDR6/SGS3. Ta kompleks pomaga prepoznati mRNA prepis TE in nastanek dsRNA. DLC2 in DLC4 nato omogočita procesiranje dsRNA, kar je ključno za nastanek 21-22 nt easiRNA. easiRNA, naložene na AGO1, lahko nato sodelujejo pri utišanju tarčne mRNA ali TE prepisa na post-transkripcijskem nivoju. Druga možnost je, da AGO2 naloži 21-22 nt easiRNA, kar sproži netipično od proteina NERD odvisno RdDM TGS (ang. transcriptional gene silencing) pot. V primeru, ko AGO6 naloži easiRNA, pa to sproži značilno RdDM, ki vodi v utišanje TE.

TE kot vir novih smRNA

Majhne obrnjene ponovitve TE (MITE) so kratki neavtonomni TE s končnimi regijami obrnjenih ponovitev. Ti elementi, ki so bili najprej opisani v rastlinah, so pretežno vstavljeni v z geni bogate regije in navadno vplivajo na izražanje sosednjih genov. Poleg regulacije izražanja genov z insercijo ali epigenetskimi modifikacijami, lahko MITE postane vir smRNA. MITE med transkripcijo proizvedejo komplementarno RNA, ki se lahko zvije v steblo-zanka podobno sekundarno strukturo, ki je dovzetna za procesiranje z DCL3. V tem primeru pride do procesiranja lncRNA s strani DCL3 v 24 nt het-siRNA molekule, ki po običajni poti sprožijo metilacijo cis ali trans, kar povzroči epigenetsko utišanje tarčnega lokusa. V rižu se od DCL3 odvisna 24 nt smRNA, ki izvira iz MITE, akumulira zaradi abiotskega stresa, kar pozitivno regulira ABA (abscizinska kislina) signaliziranje in odziv na stres.

Mutacije v zaporedju MITE vodijo tudi do nepopolnih struktur steblo-zanka, kar je lastnost miRNA prekurzorjev. To je spodbudilo razmišljanje, da so MITE verjeten evolucijski izvor miRNA lokusa. To podpira dejstvo, da se novonastale miRNA vežejo na MITE in druge TE lokuse, kar bi razložilo, zakaj se nekateri prekurzorji miRNA procesirajo tako v 21 nt kot 24 nt zvrsti. Ta ideja je dodatno podprta z ugotovitvijo, da lahko nekateri prekurzorji miRNA, ki jih prepozna DCL3, proizvajajo 24 nt siRNA in inducirajo metilacijo svojih ali tujih lokusov, kar kaže na izvor iz TE. Nadaljnja analiza potencialnega izvora miRNA genov iz TE je pokazala, da so MITE zelo dovzetne za udomačitev v miRNA prekurzorje. Spreminjanje miRNA v odvisnosti od MITE lahko tako predstavlja novosti v odzivu rastlin na razne patogene.