Biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode
Uvod
Onesnaženje s težkimi kovinami je problem s katerim se spopadamo na svetovni ravni, še zlasti pri državah v razvoju. Dejavnosti, kot so rudarjenje in taljenje rude, razne industrije (plastika, galvanizacija, tekstil, elektronka, …), kmetijstvo in odlaganje odpadkov (blato čistilnih naprav, izlužki iz deponij, kovinski odpadki, …), pripomorejo k izločanju težkih kovin v okolje. Težke kovine, kot so na primer Cu, Pb, Cd, Hg, Cr (VI), As …; se za razliko od organskih snovi ne razgrajujejo, temveč se v okolju akumulirajo. Poleg tega so to pogosto neesencialni elementi za organizme in lahko povzročajo resne zdravstvene težave [1,2].
V vodi se težke kovine sicer akumulirajo v nižjih koncentracijah (manj kot 1 mg/L), vendar še vedno predstavljajo nevarnost za okolje in človeško zdravje. Uveljavljene metode za odstranjevanje težkih kovin so: ionska izmenjava, membranska filtracija, precipitacijske metode in elektrokemijske tehnike. Precipitacija omogoča 99 % odstranjenje težkih kovin, ampak povzroča sekundarno onesnaževanje vode. Elektrokemijske metode in ionska izmenjava sta učinkovita načina odstranjevanja težkih kovin, vendar potrebujeta drago opremo in veliko energije. Membranska filtracija predstavlja dobro alternativo tem tehnikam, vendar ima kot vse ostale uveljavljene tehnike pomanjkljivost, in sicer ni uspešna pri odstranjevanju težkih kovin v nizkih koncentracijah. V tem članku so za ta namen so iz mikrobnih amiloidnih nanovlaken (MAN, Microbila Amyloid Nanofibers), ki so sposobni vezave težkih kovin, pripravili biohibridne membrane za odstranjevanje težkih kovin iz vode [2].
Priprava biohibridnih membran
Mikrobna amiloidna vlakna (MAN)
Amiloidne fibrile navadno povezujemo z nevrodegenerativnimi boleznimi, kot so Parkinsonova in Alzheimerjeva bolezen. Vendar te z β-strukturami bogate fibrile najdemo tudi v vlogah, ki so koristne organizmom. Tako imenovane funkcionalne amiloide najdemo pri človeku, glivah, še posebej pa so pogosti pri bakterijah. Tam nastopajo kot strukturni element biofilmov in so zaslužni za togost in adhezivne lastnosti teh struktur. Protein ki tvori amiloidne fibrile pri E. coli se imenuje curli. Ta tvori omrežje prepletenih fibril, ki obdajajo celice in tvori nekakšno membrano ki ščiti celice pred eksogenimi polutanti.
Za biosintezo curli vlaken so potrebni proteini zapisani na operonih csgBAC in csgDEFG. CsgA predstavlja največji strukturni element teh fibril, medtem ko csgB sodeluje pri nzkleaciji samih fibril. CsgC, csgE in csgF so šaperoni in csgG pa tvori proteinski kanal na zunanji membrani bakterije. Za tvorbo MAN so v tej raziskavi pripravili bakterije E. coli, v katere so vstavili vezje, s katerim so lahko regulirali izražanje csgA gena. To so naredili tako da so v plazmid pET22b vstavili zapis za csgA (ta je bil pod kontrolo lac operatorja) in z njim transformirali sev E. coli B21 [DE3]. Z dodatkom IPTG so v kulturi teh celic lahko inducirali tvorbo MAN.
Programirljivi MAN
Za izboljšanje adsorbcije težkih kovin na MAN, so tem dodali proteine ki so sposobni vezave težkih kovin. Fitokelatini (PCs, PhytoChelatins) so oligomeri gluttiona, ki jih sintetizira fitokelatin sintaza (PCS, PhytoChelatin Synthase), kot odgovor na prisotnost težkih kovin. Najdemo jih v rastlinah in glivah. Njihova naloga je, da zunaj celice kelirajo ione težkih kovin in jim tako preprečijo vstop v celico. Poleg fitokelatinov pa je bilo pokazano, da iscA (Iron-Sulfur Cluster Assembly) protein lahko veže tudi nekatere težke kovine.
Za vezavo teh dveh proteinov na MAN, so uporabili sistem SpyTag – SpyCatcher. Ta sistem deluje tako, da SpyTag, ki je 13 aminokislin dolg peptid, spontano tvori izopeptidno vez s svojim partenrjem SpyCatcher. Na C konec csgA so dodali SpyTag (pripravili so plazmid pET22b-csgA-SpyTag in z njim transformirali E. coli B21 [DE3]). Za kombinacijo SpyCatcher in PCS oziroma iscA pa so uporabili drug vektor, in sicer pET28a, pripravili so rekombinantna vektorja pET28a-SpyCatcher-PCS in pET28a-SpyCatcher-iscA ter z njima transformirali E. coli B21 [DE3]. S kombinacijo sevov so dobili membrano iz MAN, ki imajo vezana proteina PCS in iscA.
Biohibridne membrane
Same celice E. coli obdane z MAN so uspešne pri vezavi težkih kovin, ampak so za uporabo nepraktične. To so raziskovalci rešili tako da so jim dodali aktivno oglje. To mešanico so vakuumsko filtrirali da so dobili 0,22 μm adsorpcijski film na celulozni membrani. Tako so dobili končne biohibridne membrane.
Rezultati
Indukcija izražanja csgA in sestavljanje MAN
Celice so gojili v YES-CA gojišču. Izražanje csgA so sprožili z dodatkom IPTG (končna koncentracija 0,5 mM). Raven izražanje so spremljali preko barvanja z barvilom Congo rdeče na intervalu 48 – 72 h po indukciji. Za kontrolo so uporabili E. coli B21 [DE3] transformirane s praznim pET22b vektorjem. Maksimalno raven izražanja so opazili 72 h po indukciji. Rezultat indukcije so preverili tudi s presevnim elektronskim mikroskopom, kjer so opazovali morfologijo amiloidnih struktur zunaj celic. Za rekombinantni sev so pokazali večjo rast amiloidnih vlaken, kar je pomenilo da jim je uspelo pripraviti celice, ki so v povečani meri izražale csgA.
Sposobnost absorbcije Pb2+ na MAN
