Sintetična celična linija za inducibilno pakiranje virusa influence A

Povzeto po: Synthetic Cell Lines for Inducible Packaging of Influenza A Virus

Uvod

Virus influence A (ang. influenza A virus; IAV) je eden izmed najbolj razširjenih človeku škodljivih patogenov. Gripa, ki jo povzroča ta virus, je ena izmed najbolj ponavljajočih se in razširjenih nalezljivih človeških bolezni po vsem svetu. IAV še vedno predstavlja izziv za zdravljenje z obstoječimi cepivi in protivirusnimi zdravili, saj ima virus sposobnost nenehnega spreminjanja [1]. Trenutno se za obrambo pred okužbo z IAV uporabljajo inaktivirana ali oslabljena virusna cepiva, za pripravo katerih se uporabljajo embrionalna kokošja jajca ali kulture sesalskih celic. Ti dve metodi pa sta zamudni in nagnjeni k mutacijam, ki vodijo v manj učinkovita cepiva [2].

IAV je (-)ssRNA virus, obdan z membransko ovojnico, ki vsebuje osem genskih segmentov, ki jih lahko označimo kot vRNA. Vsaka vRNA je obdana z nukleoproteini (NP) in vsebuje kompleks proteinov PA, PB1 in PB2, ki skupaj tvorijo od RNA odvisno RNA polimerazo (RdRP). RdRP lahko ob prepisovanju vRNA povzroči antigenski premik (ang. antigenic drift), ki povzroči spremembe v genih virusa in posledično mutacije v hemaglutininu (HA) in nevraminidazi (NA) [2].

Ko virus vstopi v gostiteljsko celico RdRP začne prepisovati vRNA. Nastanejo molekule mRNA iz katerih se nato prevedejo virusni proteini. RdRP nato uporabi vRNA kot matrico za sintezo novih (+)RNA molekul, ki se imenujejo cRNA in služijo kot matrica, da lahko RdRP naredi več kopij genomskih vRNA. Osem vRNA genomskih segmentov in 10 virusnih proteinov se nato pakira v virusne delce. Za pripravo IAV v sesalskih celicah torej potrebujemo RdRP kompleks, NP proteine in osem vRNA molekul, da nastanejo virusni delci [2].

Priprava celičnih linij

Cilj je bil narediti stabilno celično linijo, ki jo lahko spodbudimo k proizvodnji IAV s transfekcijo genov za HA in NA, značilnih za specifični sev. Posamezne gene IAV so razporedili v tri sete: 1) iniciacijski set z mRNA zaporedjem za RdRP pod kontrolo TetON promotorja [2]. TetON promotor je inducibilni promotor, ki ga lahko aktiviramo z doksiciklinom [3]. Druga dva seta pa sta 2) genomski set z zapisom za vRNA, ki zapisuje za RdRP in NS (ang. non-structural protein) in 3) ojačevalni (»booster«) set, ki vsebuje vRNA in mRNA za NP in M. Posamezne sete so integrirali v genom celic HEK293T, da so na koncu pripravili stabilno celično linijo, ki so jo poimenovali »inducible master donor cells« (iMD) [2].

Vzpostavitev stabilne inducibilne integrirane celične linije (iRdRP)

HEK293T celično linijo so transfecirali s tremi lentivirusnimi vektorji iniciacijskega seta, da so sintetizirali iRdRP celično linijo. Aktivnost integriranega zapisa za RdRP so potrdili s testom replikacije segmenta genoma. Ta test uporablja plazmida PI-ΔHA-GFP in pDZ-NP. Prvi kodira vRNA za ΔHA-GFP, kjer je CDS za zeleni fluorescenčni protein (GFP) vstavljen med neprevajajoči se regiji vRNA za HA. Plazmid pDZ-NP, kjer celotno zaporedje za NP prepisujeta polimeraza I (Pol I) in polimeraza II (Pol II) v nasprotni smeri, pa izraža tako vRNA kot mRNA za NP. RdRP in proteini NP prepoznajo neprevajajoče se regije in tvorijo kompleks, ki omogoča od RdRP odvisno transkripcijo, kjer nastane GFP. Dokazali so, da tako pripravljena celična linija ob kotransfekciji prej omenjenih proteinov in indukciji z doksiciklinom proizvaja GFP, in tako potrdili, da celična linija izraža aktivno RdRP in NP proteine. Tako pripravljeno celično linijo so poimenovali iRdRP. IRdRP celice so nadaljnje pregledali za njihovo zmožnost priprave virusnih delcev. To metodo so uporabili tudi pri vseh kasneje sintetiziranih celičnih linijah. Za lažje razumevanje je ta metoda opisana pri celični liniji iRdRP 4v [2].

Celična linija, ki izraža 4 vRNA virusa influence (iRdRP 4v)

iRdRP celice so transfecirali z genomskim setom, ki nosi zapis za vRNA PB2, PB1, PA in NS, skupaj s transpozazno mRNA, ki je omogočila integracijo genomskega seta v genom celic iRdRP. Dokazali so, da indukcija izražanja vRNA in mRNA za PA, PB1, PB2 in NS močno poveča izražanje teh molekul v primerjavi z neinducirajočimi pogoji. Prisotnost molekule mRNA za NS, ki jo celice lahko proizvedejo le iz njene vRNA, predstavlja dodaten dokaz, da je bila prisotna aktivna RdRP, ki je bila sposobna vRNA za NS prepisati v mRNA. Integracijo vseh štirih genomskih segmentov so dodatno potrdili s kvantifikacijo števila kopij v teh klonih. Tako pripravljeno celično linijo so imenovali iRdRP 4v [2].

iRdRP celice so nadalje ovrednotili glede na njihovo zmožnost priprave virusa sciΔHA (ang. single cycle infectious ΔHA) in virusa PR8 [2]. PR8 virus je virus gripe, za katerega je znano, da povzroča hude okužbe pri miših [4]. Set treh plazmidov z zapisom za vRNA in mRNA genov NP, M in NA so kotransfecirali pri inducibilnih pogojih z dodanima plazmidoma PI-ΔHA-GFP in pCAGGS-HA za sciΔHA virus in plazmidom pDZ-NP za virus PR8. Plazmid pCAGGS-HA nosi mRNA zapis za HA, pod kontrolo Pol II. Pri virusu PR8 so količino nastalega virusa pregledali z virusno titracijo supernatanta po infekciji celic MDCK, medtem ko so pri sciΔHA supernatant uporabili za infekcijo MDCK-HA celic in so prisotnost nastalega virusa določili s štetjem GFP pozitivnih celic. iRdRP 4v celična linija je prva demonstracija sinteze IAV genomskih vRNA iz v gostitelja integriranih genovov in posledično pakiranja v virusne delce, ki so sposobni okužbe [2].

Inducibilne glavne celice darovalke (iMD)

iRdRP 4v celice so nadalje modificirali tako, da so integrirali tudi ojačevalni set, ki sestoji iz genov za NP in M pod promotorjem Pol I in inducibilnim promotorjem Pol II pSwitch, ki ga lahko induciramo z dodatkom mifepristona. Ponovno so pregledali zmožnost pakiranja virusa sciΔHA in virusa PR8, ter karakterizirali vpliv različnih pogojev indukcije na zmožnost replikacije virusnega genoma. Karakterizacijo so izvedli z uporabo pretočne citometrije, kjer so merili emitiran GFP signal. Ugotovili so, da je indukcija TetON imela glavni vpliv na sintezo virusnih proteinov in podvojevanje virusnega genoma, medtem ko je koindukcija pSwitch le malo izboljšala virusni titer [2].

Celice iMD so uporabili za pripravo virusa IAV-PR8. Transfecirali so jih s pDZ-NA in pDZ-HA ter inducirali z doksiciklinom in mifepristonom. Supernatant te kulture so uporabili za okužbo celic MDCK in detektirali prisotnost virusa PR8. Dokazali so, da se iMD celice lahko uporabljajo kot inducibilna pakirna celična linija za generiranje IAV virusov [2].

Dinamika virusne RNA v celicah iMD

Kljub temu, da so uspešno pripravili nalezljiv virus IAV, pa je bil končni proizveden titer sorazmeroma majhen. Da bi bolje razumeli dejavnike, ki omejujejo učinkovitost pakiranja virusa v celični liniji, so opravili analizo transkriptoma na celicah iMD, transfeciranih s pDZ-HA in pDZ-NA ter induciranih z doksiciklinom in mifepristonom. Podatke so analizirali s predhodno narejenim programom InVERT, ki kvantificira protismerno vRNA, smerno cRNA in mRNA, ki jo proizvede IAV lastna RdRP [2].

Ugotovili so, da je indukcija močno povišala količino vseh nastalih molekul RNA. Prisotnost posameznih molekul RNA pa je bila vseeno znatno manjša kot pri okužbi celic z IAV. V najmanjši meri so bile prisotne vRNA molekule, kar lahko predstavlja ozko grlo pri sintezi IAV. Da so potrdili to hipotezo so ocenili učinek povečanja proizvodnje IAV v celicah iMD s prekomernim izražanjem vRNA molekul z zapisom za PA, NP, M in NS. Celice so kotransfecirali s plazmidi, ki so imeli zapis za prej omenjene gene in opazili približno 102-kratno povečanje titra virusa PR8, kar nakazuje, da potencialno zvišanje ravni vRNA teh genov poveča število pakiranih virusnih delcev [2].

Odziv gostiteljskih celic na virus v celicah iMD

Okužba z IAV v gostiteljskih celicah sproži številne odzive, kot so zaustavitev transkripcije in translacije, vnetne reakcije in protivirusne odzive. V primeru iMD celic virusni material nastaja endogeno, za razliko od klasične eksogene okužbe z virusom. Odziv celic so raziskali tako, da so preučili transkriptom iMD celic 48 ur po transfekciji z pDZ-HA in pDZ-NA in po indukciji. Ugotovili so, da se transkriptom takšnih celic močno razlikuje od neinduciranih in netransfeciranih in tudi navadnih gostiteljskih celic [2].

Opazili so, da je bila, glede na HEK293T celice, prisotna povečana koncentracija genov za boj proti virusom že pred indukcijo, nekateri geni pa so se začeli povečano izražati šele po indukciji. Med geni, ki so bili prisotni v višjih koncentracijah, je bil DDX58 (RIG-I), receptor prirojenega imunskega sistema. Le-ta zazna v citoplazmi prisotno virusno RNA in sproži nadaljnje signalne poti, med njimi tudi sintezo IFNjev in provnetnih citokinov. Drugi geni so tudi IRF7, IFITM1, ISG20 in OAS3. Povečanje izražanja genov je verjetno posledica konstitutivnega izražanja vRNA in potencialno tudi puščanja promotorja za RdRP. Povečano izražanje teh genov okrepi obrambo celic pred virusom in negativno vpliva na proizvodnjo IAV. Nadaljnje bi lahko naredili celično linijo z izbitimi protivnetnimi virusi ali pa bi zmanjšali izražanje teh genov in znižali raven puščanja promotorja integriranih virusnih elementov [2].

Zaključek

V študiji so uspešno izdelali dokazno celično linijo, ki je zmožna proizvajati nalezljive IAV z nadzorovanim izražanjem vseh virusnih komponent. Sintetična celična linija odstrani potrebo po predhodni kotransfekciji velikega števila plazmidov za generiranje nalezljivih virusov. Analiza transkriptoma celičnih linij je prikazala ozka grla, ki jih lahko ciljamo za izboljšanje proizvodnje IAV, med njimi tudi nizke koncentracije vRNA in povečano koncentracijo protivirusnih genov. S prikazom izvedljivosti razvoja celične linije za pakiranje IAV je ta študija razkrila številne možnosti za optimizacijo tega sintetičnega sistema in njegove morebitne uporabe v industriji cepiv.

Literatura

1. Influenza A Virus and Acetylation: The Picture Is Becoming Clearer - PMC. [cited 28 Mar 2024]. Available: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10820114/ 2. Phan T, Ye Q, Stach C, Lin Y-C, Cao H, Bowen A, et al. Synthetic Cell Lines for Inducible Packaging of Influenza A Virus. ACS Synth Biol. 2024;13: 546–557. doi:10.1021/acssynbio.3c00526 3. Das AT, Tenenbaum L, Berkhout B. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther. 2016;16: 156–167. doi:10.2174/1566523216666160524144041 4. Rutigliano JA, Sharma S, Morris MY, Oguin TH, McClaren JL, Doherty PC, et al. Highly Pathological Influenza A Virus Infection Is Associated with Augmented Expression of PD-1 by Functionally Compromised Virus-Specific CD8+ T Cells. J Virol. 2014;88: 1636–1651. doi:10.1128/JVI.02851-13