OPHAelia
oPHAelia je projekt ekipe iz Tesalije, ki je leta 2023 tekmovala na iGEM sinteznem tekmovanju. Predtavitev projekta je dostopna na povezavi https://2023.igem.wiki/thessaly
Uvod
Na svetovni lestvici proizvodnje oljčnega olja je Grčija na tretjem mestu, saj proizvede 18 % svetovnega oljčnega olja. Tesalija kot majhna regija proizvede manj kot 10 % grškega oljčnega olja. Glavni problem pri proizvodnji oljčnega olja je odpadna voda – (ang. Olive Oil Mill Wastewater – OMW), strupeni stranski produkt, ki močno ogroža okolje. Na vsak 1 kg oljčnega olja nastane 1.25 kg OMW. V Grčiji letna proizvodnja OMW dosega približno 2,5 milijona kubičnih metrov [1]. OMW je temno rjave barve, kisle narave, z vrednostmi pH v razponu od 2 do 6 in oddaja močno oster in škodljiv vonj, tudi na dolge razdalje in zlasti med obdobji proizvodnje oljčnega olja. Predstavlja kompleksna zmes, sestavljena iz različnih organskih in anorganskih spojin, zaradi česar je pomembna okoljska skrb. OMW je sestavljena iz fenolnih spojin, kot so hidroksitirozol, protokatehuinska, p-kumarinska kislina, vaniljeva in kofeinska kislina, za katero je značilna kemijska potreba po kisiku - COD 30–320 g/L in biokemijska potreba po kisiku - BOD 35–132 g/L. Ko se sprosti v vodna telesa, kot so potoki ali reke, se lahko zmanjša razpoložljivost kisika, kar poruši ravnovesje celotnega ekosistema. Poleg tega, ko se neobdelan OMW odloži v zemljo, negativno vpliva na njeno poroznost. Posledično sta ovirana razvoj favne in dihanje korenin, kar vpliva na splošno zdravje tal [1].
Rešitev
Da bi odpravili problem z odpadne vode oljčnega olja, je iGEM ekipa iz Tesalije oblikovala sistem oPHAelia – sistem zasnovan na sintetični konzorcij dveh bakterij za učinkovito bioremediacijo OMW in njegovo biopretvorbo v izdelek visoke vrednosti. Sistem temelji na vzajemno koristni simbiozi dveh bakterij: Escherichia coli (E. coli) in Pseudomonas putida (P. putida). Prvi gostiteljski organizem, uporabljen v sintetičnem konzorciju, je E. coli, natančneje sev DH5-alfa, derivat seva K-12, da bi ustvarili genetske konstrukte. Sev E. coli BL21-DE3 je eden od šasijskih organizmov, ki so bili vključeni v sintetični konzorcij. Specifični sev, derivat seva E. coli B, je bil uporabljen za izražanje zasnovanih konstruktov za proizvodnjo bistvenih proteinov za detoksikacije oljčne odpadne vode (OMW), nastajanje in izločanje prostih maščobnih kislin (ang. Free Fatty Acids - FFA) [1]. P. putida, robustna bakterija z edinstvenim razgradljivim metabolizmom, bo pretvorila monomerne fenolne spojine (fenolne kisline), sladkorje (predvsem glukozo) in proste maščobne kisline iz E. coli v izdelek visoke vrednosti s posebnimi sistemi, povzročenimi s substratom. Poleg tega je zelo pomembna tudi predelava izdelka. Zato v P. putida so integrirali programabilni sistem za lizo na osnovi lizocima za učinkovito in cenovno ugodno zbiranje končnega izdelka. Predlagana je bila izgradnja sintetičnega konzorcija med sevi P. putida KT2440 in E. coli za povečanje kopičenja PHA. Sintetični konzorciji širijo obseg metaboličnega inženiringa in sistemu zagotavljajo številne prednosti v procesu detoksikacije in proizvodnji polihidroksialkanoate - PHA, saj se procesi delijo med dvema bakterijama, kar ima za posledico manjši presnovni stres in izboljša proizvodnjo, PHA. Ta dvojni bakterijski pristop omogoča celovit proces detoksikacije, ki cilja na več organskih sestavin OMW hkrati [1]. Polihidroksialkanoati (PHA) so skupina biološko razgradljivih poliestrov, ki jih lahko bakterije in arheje kopičijo v svojih celicah pod posebnimi stresnimi pogoji in služijo kot sredstvo za shranjevanje ogljika in energije. Poleg tega biopolimeri imajo podobne mehanske in fizikalne lastnosti kot različne sintetične plastike, kot sta polipropilen in polistiren. Predstavljajo trajnostni način za boj proti onesnaževanju s plastiko, saj lahko bioplastika na osnovi PHA za razliko od tradicionalne plastike, ki ima življenjsko dobo med 100 in 1000 let, razpade na vodo (H2O) in ogljikov dioksid (CO2) v 20 do 45 dneh, če je v odprtem okolju primerna vlaga, kisik in zadostno število mikrobov [3].
Mehanizem delovanja
E. coli bo pod določenimi pogoji proizvajala in izločala lakazo gliv bele trohnobe za razgradnjo polimernih fenolnih spojin (tanini, lignani, katehol melaninski polimeri), frakcije prisotne v OMW. Poleg tega bo E. coli prednostno izkoriščala med drugim tudi sladkorje, kot so arabinoza, ksiloza in galaktoza, ki jih P. putida ne more katabolizirati, in izločala proste maščobne kisline. Izražanje acetil-CoA karboksilaze in acil-ACP tioesteraze iz rastline Ricinus communis v E. coli bo olajšalo zagotavljanje dolgoverižnih maščobnih kislin za P. putida, s čimer bo spodbudilo proizvodnjo srednje dolgih PHA (mcl-PHA), sestavljeni iz monomerov s 6-14 ogljikovimi atomi [2]. Da bi zagotovili natančen nadzor teh genetskih sistemov, so vključili dodatna regulacijska vezja, kot je regulacijsko vezje z negativno povratno zvezo, ki temelji na senzorju-aktivatorju na osnovi malonil-CoA [1].
Cilj
Cilj oPHAelia je poudariti prednosti in pomagati pri prehodu na uporabo PHA kot alternativo plastiki na osnovi nafte, ki ne le pomaga zmanjšati vpliv onesnaževanja s plastiko na okolje, ampak tudi ustvarja nove priložnosti za industrijo, da sprejme bolj okolju prijazne materiale.
Oblikovanje sistema
Da bi olajšali razumevanje, so sistem razdelili na štiri glavne osi: razstrupljanje OMW, proizvodnja PHA, predelava PHA in nazadnje vidik biološke varnosti, ki zagotavlja biološko zadrževanje gensko spremenjenih bakterij, vsa dejanja, h katerim prispevata obe bakteriji [1].
P. putida proizvaja PHA po dveh poteh, ena z uporabo virov ogljika, povezanih s PHA, in druga pot, ki uporablja vire ogljika, ki niso povezani s PHA. Razvili so dve regulacijski vezji, katerih cilj je izražanje ključnih encimov iz obeh poti, kar na koncu vodi do kopičenja osrednjega prekurzorja PHA (R)-3-hidroksiacil-CoA, substrata za obe polimerazi PHA. E. coli je bila zasnovana za učinkovito proizvodnjo in izločanje prostih maščobnih kislin s prefinjenim sistemom negativne povratne informacije, ki temelji na malonil-CoA in heterologni ekspresiji rastlinske acil-ACP tioesteraze. Malonil-CoA se sintetizira iz acetil-CoA z acetil-CoA karboksilazo, ki jo kodira accABCD (acc). Da bi povečali oskrbo z malonil-CoA in hkrati preprečili škodljive učinke čezmernega izražanja acc, so razvili sistem, ki lahko zazna ravni malonil-CoA in uravnava izražanje acc. Okrevanje PHA so omogočili s pomočjo sistema za lizo na osnovi lizocima za obnovitev PHA, ki ga uravnava ekspresijski sistem MekR / PmekA. Sistem deluje tako da metil etil keton (MEK) se veže na regulatorni protein MekR in kot kompleks povzroči indukcijo PmekA, ki aktivira transkripcijo lizocima. Ko je preveden, se lizocim premakne v periplazmatski prostor in povzroči razpad celične strukture. Eden glavnih ciljev je bil zagotoviti varnost sistema, kar pomeni, da bi bil v nadzorovanem okolju (bioreaktor) in ne bi preživel zunaj njega. To je mogoče doseči tako z mehansko zasnovo bioreaktorja kot z biološko zasnovo, ki so jo razvili na podlagi mehanizmov soodvisnosti in dvojne avksotrofije. Sistem dvojne avksotrofije in lize deluje tako da P. putida nosi modifikacije za prekomerno proizvodnjo in izločanje aminokisline Trp, medtem ko E. Coli prekomerno proizvaja in izloča Tyr. Ko se MekR/PmekA aktivira, se P. putida lizira in tako ne more več zagotavljati Trp E. coli, posledično mikrobni konzorcij propade [1].
Delovanje sistema
Prvi korak postopka vključuje zbiranje oljčne odpadne vode (OMW) iz mlinov za oljčno olje in njen transport v objekt za bioremediacijo. V tem objektu bo nameščen specializiran bioreaktor, ki bo olajšal proces detoksikacije in optimiziral rast in aktivnost sintetičnega konzorcija. Primarni namen bioreaktorja je ustvariti nadzorovano okolje, ki zagotavlja idealne pogoje za rast P. putida in E. coli, ključnih mikroorganizmov, ki sodelujejo v procesu. Parametri, kot so temperatura, pH, razpoložljivost hranil in ravni kisika, bodo skrbno regulirani, da se zagotovi, da proces detoksikacije deluje z največjo učinkovitostjo. Ko bo postopek detoksikacije končan, bodo nastale PHA dostavljene podjetjem za bioplastiko. Po detoksikaciji in proizvodnji PHA je potrebno detoksicirano vodo ločiti od bakterij, ki vsebujejo granule. Biomasa se s filtrirno stiskalnico loči od OMW in prenese v rezervoar. PHA se pridobivajo iz biomase. Pred začetkom ekstrakcije s topilom je treba dodati etanol, za optimizacijo končne čistosti PHA z odstranitvijo lipidov in drugih v etanolu topnih komponent, ki niso PHA. Naslednji korak je ekstrakcija s topilom, z etanolom obdelana biomasa se zmeša z majhnimi odmerki metil etil ketona (MEK). Dodatek MEK aktivira sistem za lizo na osnovi lizocima v P. putida, kar olajša ekstrakcijo zrnc PHA. Frakcija PHA-topilo loči se od biomase s centrifugiranjem. Po pridobitvi posušenih in prečiščenih PHA je potreben dodaten postopek ekstrudiranja za njihovo pretvorbo v pelete. Mešanica aditivov in surove plastike se prenese v peletizer, kjer se predela v pelete [1].
Zaključek
Z eksperimenti in oblikovanjem samega sistema so potrdili, da so bakterijski sintetični konzorciji zelo močna in pomembna naprava v procesu bioremedijacije. Tudi da sam proces bioremedijacije predstavlja zelo pomemben v reševanju onesnaževanja s plastiko in lokalnih odpadkov, kot je odpadna voda oljčnega olja, s katerimi se pogosto nepravilno ravna [1].
Viri
[1] Thessaly iGEM 2023. Pridobljeno s: https://2023.igem.wiki/thessaly [Dostopano 7 april 2024]
[2] Qin, R., Zhu, Y., Ai, M., & Jia, X. (2022). Reconstruction and optimization of a Pseudomonas putida-Escherichia coli microbial consortium for mcl-PHA production from lignocellulosic biomass. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 10, 1023325.
[3] Acharjee, S. A., Bharali, P., Gogoi, B., Sorhie, V., Walling, B., & Alemtoshi (2023). PHA-Based Bioplastic: a Potential Alternative to Address Microplastic Pollution. Water, air, and soil pollution, 234(1), 21.
