Sublimestone

Sublimestone je projekt študentske ekipe MSP Maastricht, s katerim so leta 2023 sodelovali na tekmovanju iGEM. Prejeli so zlato medaljo in se uvrstili med deset najboljših študentskih ekip.

Avtorica povzetka: Ana Maučec

Ozadje projekta in problem

Številne stavbe in spomeniki izjemnega kulturnega pomena, kot npr. Partenon in piramide v Gizi so zgrajeni iz apnenca. Tudi na območju mesta Maastricht in v okolici je apnenec široko uporabljan material vse do današnjih časov. Na območju province Limburg, katere središče je mesto Maastricht, je še posebej znana posebna vrsta apnenca t. i. Mergel [1]. Apnenec je karbonatna sedimentna kamnina, ki je pretežno sestavljena iz kalcijevega karbonata(CaCO3), najpogosteje v obliki kalcita ali aragonita (različni kristalni obliki), in dolomita (CaMg(CO3)2), vsebuje pa lahko še druge primesi (npr. kremen, ilovica …) [2]. Sestava in struktura apnenca sta lahko glede na geografski izvor zelo različni, vsi tipi pa so še posebej nagnjeni k eroziji in preperevanju. Daljše deževne sezone, ki so posledica podnebnih sprememb, onesnaževala v zraku in kisli dež pa deterioracijo apnenca samo še pospešujejo. Ohranjanje apnenca je zaradi razlik v sestavi in zgradbi, poroznosti in trdoti zahtevno in odvisno od tipa apnenca. Trenutni postopki za konzervacijo in restavracijo apnenca vključujejo predvsem čiščenje površine z različnimi mehanskimi metodami in laserji, nadomestitev apnenca z alternativnim materialom ter zapolnitev razpok. Slednje dosežejo predvsem z vbrizgavanjem adhezivnih sredstev, kot so epoksi smole, v razpoke. S temi postopki lahko trenutno dosežemo le omejene rezultate, saj se izgled materiala pogosto spremeni, vprašljiva pa sta tudi vpliv na okolje in cenovna vzdržnost takšnih restavratorskih posegov. Prav tako ti postopki niso univerzalni in jih je treba prilagoditi tipu apnenca [1].

Cilji projekta

Glede na številne izzive, s katerimi se soočajo restavratorji in konzervatorji umetnin in stavb kulturnega pomena iz apnenca, je razvoj novih, čim bolj univerzalnih tehnik za njegovo obnovo in ohranjanje zelo zaželen. Študentska ekipa iz Maastrichta je zaradi te problematike v lokalnem okolju želela zasnovati sistem, ki bi s pomočjo mikroorganizmov lahko popravljal razpoke v apnencu. Pri tem so uporabili dva različna seva E. coli: eden proizvaja hidrogenkarbonatne ione (HCO3-), ki s Ca2+ ioni v okolju tvorijo kalcit, drugi pa proizvaja ssDNA, ki se zvije v oktaedričen DNA-origami, ki predstavlja nukleacijsko jedro in ogrodje za biomineralizacijo kalcita [1].

Biomineralizacija kalcita

V prvem delu so pripravili bakterije, ki lahko proizvajajo kalcit (CaCO3). Številne bakterijske vrste so zmožne precipitacije CaCO3, npr. žveplo-reducirajoče bakterije in tiste, ki vsebujejo encim ureaza. Encima, ki s proizvodnjo hidrogenkarbonatnih ionov omogočata nastanek kalcita pri teh mikroorganizmih, sta ureaza in karboanhidraza. Za svoj sistem so izbrali slednjo, saj pri razgradnji uree z ureazo nastaja še amonijak, kar ni zaželeno. Karboanhidraza katalizira reakcijo hidracije CO2 do HCO3-. Uporabili so karboanhidrazo α-SazCA iz termofilne bakterije Sulfurihydrogenibium azorense, ki je najučinkovitejša znana karboanhidraza (kcat/Km = 3,5 * 108 M-1 s-1). Encim α-SazCA ima 2,33-krat višjo katalitično aktivnost kot človeška karboanhidraza II in ohrani visoko razmerje kcat/Km pri različnih vrednostih pH in temperature. Encim so pripravili kot fuzijo z N-koncem membranskega proteina INPN (angl. ice nucleation protein). Pred zapis za INPN so dodali signalni peptid pelB, ki je rekombinantni protein usmeril v periplazmo, zapisu za INPN je sledilo kratko zaporedje Re, ki zboljša stabilnost IPNP, in fleksibilen linker (GGGS)3. Na konec zapisa za α-SazCA so dodali heksahistidinsko oznako [1]. Zasnovo fuzijskega proteina so povzeli po [3]. Fuzijski protein je bil tako usidran v zunanji bakterijski membrani. S tem so zagotovili, da koncentracija substrata (CO2) v celici ni bila omejena s permeabilnostjo plazmaleme za ogljikov dioksid, poleg tega pa so se nastali ioni HCO3- nahajali neposredno v zunajceličnem okolju in so lahko s tam prisotnimi Ca2+ ioni tvorili CaCO3. Vektorski konstrukt so izrazili v celicah E. coli Bl21[DE3] in prisotnost proteina v celičnih lizatih potrdili s prenosom western in detekcijo s protitelesi proti heksahistidinski oznaki. Zaradi domnevnega puščanja promotorja so v gojišče pred indukcijo dodajali tudi različno koncentracijo glukoze [1]. Encimsko aktivnost α-SazCA so preverili s kolorimetričnim testom hidracije CO2 [4] .

Rezultati biomineralizacije

Nato so izvedli in vitro test mineralizacije, da bi preverili ali v njihovem sistemu sploh pride do proizvodnje kalcita. 3 h po indukciji izražanja z IPTG so bakterijsko kulturo centrifugirali in peletu dodali nasičeno raztopino CO2 pri 0 °C. Po enourni inkubaciji na ledu so po centrifugiranju supernatantu dodali vir Ca2+ (CaCl2) in po 12 h posušili nastali produkt. Vzorec so najprej analizirali z IR-spektroskopijo in zaznali absorpcijske trakove pri valovnih številih, značilnih za vibracije vezi v CO32-. Poleg tega so zaznali še prisotnost organskih kontaminant in H2O. Ker niso zaznali značilnih trakov za vaterit in aragonit (dve kristalni obliki CaCO3), bi nastali vzorec lahko predstavljal kalcit, a bi morali za potrditev opraviti še analizo vzorca z rentgensko difrakcijo [1]. Vzorec so nato analizirali še s termogravimetrično analizo (TGA), kjer snov med segrevanjem ves čas tehtamo in lahko na ta način opazujemo različne procese kot so npr. fazni prehodi v materialu, adsorpcija in absorpcija, ter ga na ta način okarakteriziramo [5]. Temperatura, pri kateri CaCO3 razpade se giblje med 800 °C in 850 °C. Pri vzorcih po in vitro mineralizaciji so izmerili nekoliko višjo temperaturo degradacije, kar so pripisali nastanku bolj stabilne strukture zaradi predhodnega sušenja vzorca. Ta bi zaradi visoke stabilnosti lahko predstavljal kalcit. Za nedvoumno potrditev, da bakterije res proizvajajo CaCO3 v obliki kalcita, pa bi bile potrebne nadaljnje raziskave [1].

Proizvodnja DNA-ogrodja

V drugem delu so pripravili bakterije E. coli, ki proizvajajo ssDNA. Enoverižna DNA se s pomočjo oligonukleotidnih zaporedij, ki so komplementarna določenim delom zaporedja ssDNA, zvije v DNA-origami v obliki oktaedra, ki zagotavlja nukleacijsko jedro za tvorbo kalcita. Hkrati predstavlja tudi biološko ogrodje za material v razpokah. V odsotnosti nukleacijskega jedra bi namreč prišlo do tvorbe amorfnega kalcijevega karbonata (ACC), ki je manj odporen na mehanske strese kot kalcit. Enoverižno DNA so proizvedli s pomočjo bakterij E. coli, vendar so tokrat izbrali sev DH5α. Za proizvodnjo ssDNA so uporabili komercialni fagmid, ki je že vseboval ustrezno zaporedje za ssDNA ter pomožni plazmid, ki vsebuje dele genoma nitastega faga M13 brez M13 ori in drugih regulatornih zaporedij, potrebnih za nastanek fagnih delcev. Glede na zaporedje ssDNA, ki je bilo vstavljeno v komercialni fagmid, so s pomočjo računalniškega programa TALOS načrtali ustrezne oligonukleotide, ki bodo komplementarni ustreznim delom ssDNA, da bo prišlo do nastanka oktagonalnega DNA-origamija. Posamezne oktaedre so s t. i. lepljivimi konci povezali v večjo DNA-strukturo. Lepljive konce predstavljajo določeni komplementarni oligonukleotidi, ki so podaljšani z zaporedjem 10 dTTP in 10 bp dolgimi zaporedji. Le ta so komplementarna na dveh sosednjih oktaedrih. S pomočjo računalniškega algoritma, ki so ga napisali sami, so določili katere oligonukleotide morajo podaljšati in kakšno mora biti njihovo zaporedje, da bo prišlo do nastanka želene DNA-strukture. Pred proizvodnjo ssDNA v bakterijah so jo proizvedli in vitro in testirali vpliv temperature, koncentracije MgCl2 v pufru ter različnih razmerij koncentracije ogrodja in oligonukleotidov. Razlike med posameznimi vzorci niso bile izrazite – dva izmed njih so analizirali s transmisijskih elektronskim mikroskopom (TEM). V obeh vzorcih so zaznali podobno oblikovane strukture, za katere pa brez dodatnih analiz, npr. z vrstičnim elektronskim mikroskopom (SEM) ne morejo trditi, da so se sestavile v želeno obliko ogrodja [1].

Popravljanje razpok v apnencu

Pred potencialno uporabo sistema v zunanjem okolju so želeli najprej potrditi delovanje posameznega modula in ju nato testirati skupaj, vendar jim bakterijske proizvodnje ssDNA še ni uspelo potrditi. Pred nanosom v razpoko bi bakterije, ki proizvajajo kalcit in ssDNA ujeli v alginatne kroglice, ki vsebujejo kalcijeve ione. V prihodnje načrtujejo optimizacijo proizvodnje enoverižne DNA v bakterijah in izvedbo biomineralizacije v mediju, ki vsebuje DNA-origami, CaCl2 in CO2(aq) [1]. Za vizualizacijo kalcita znotraj DNA-ogrodja bi uporabili konfokalno mikroskopijo – barvilo syntox zeleno obarva DNA, za kalcit pa je značilna rumena avtofluorescenca [6]. Na koncu bodo morali optimizirati še ujetje bakterij v alginatne hidrogele in preizkusiti delovanje njihovega sistema v razpokah v apnencu. Prav tako želijo pred uporabo GSO v okolju v bakterijah uporabiti sistem toksin-antitoksin MazEF, z uporabo katerega bi lahko s koncentracijo arabinoze v mediju regulirali preživetje bakterij in tako izboljšali biološko varnost sistema [1].

Literatura

[1] Sublimestone: Biotechnologies for Preserving Cultural heritage. MSP Maastricht iGEM 2023. https://2023.igem.wiki/msp-maastricht/ (pridobljeno 30. apr. 2024)

[2] Limestone. Britannica. https://www.britannica.com/science/limestone (pridobljeno 30. apr. 2024)

[3] Y. Zhu, Y. Liu, M. Ai, X. Jia. Surface display of carbonic anhydrase on Escherichia coli for CO2 capture and mineralization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2022,7,460–473. doi:10.1016/j.synbio.2021.11.008

[4] J. H. Kim, B. J. Jo. A Colorimetric CO2 Hydration Assay for Facile, Accurate, and Precise Determination of Carbonic Anhydrase Activity. Catalysts. 2022,12,1391. doi:10.3390/catal12111391

[5] Thermogravimetric analysis (TGA). Chemistry LibreTexts. https://chem.libretexts.org/Courses/Franklin_and_Marshall_College/Introduction_to_Materials_Characterization__CHM_412_Collaborative_Text/Thermal_Analysis/Thermogravimetric_analysis_(TGA) (pridobljeno 30. apr. 2024)

[6] L. A. Ivanova, D. A. Golovkina, E. V. Zhurishkina, Y. E. Gorshkova, A. D. Yapryntsev, A. E. Baranchikov, et al. Structure Evolution of CaCO3 Precipitates Formed during the Bacillus cereus Induced Biomineralization. Minerals. 2023,13,740.