FluoroLoop

Seminar na osnovi iGEM project [1]

Uvod

Problematika PFAS

Per- in polifluorinirane alkil snovi, ki jih poznamo pod kratico PFAS, so pestra skupina sintetičnih kemikalij, ki se uporabljajo za proizvodnjo produktov s fluoropolimernimi premazi približno od leta 1950 - od posode proti prijemanju, dežnih plaščev do ognjevarnih pen. So dolgotrajni okoljski onesnaževalci, ki lahko povzročajo izgubo biodiverzitete, rakava obolenja in neplodnost. Gre za skupino ti. »večnih kemikalij« oziroma forever chemicals, ki so močno ali popolnoma fluorirane. Zaradi vezi C-F so zelo stabilne, kar je v določenih primerih izredno uporabna lastnost, a obenem predstavlja veliko breme za okolje – same od sebe namreč ne razpadejo, za razgradnjo večinoma potrebujejo temperature višje od 1100 ^oC, mikroorganizmi jih načeloma ne morejo razgraditi. Znani so tudi kot bioakumulanti in imajo za človeka številne negativne posledice [1-3].

Določanje PFAS

Zaenkrat se za določanje PFAS v vzorcih odpadne vode uporabljajo:

• • kromatografske metode:

­***LC-MS (tekočinska kromatografija in masna spektrometrija)

• • • GC-MS
  • semi-kvantitativne metode:
    • TOP (total oxidizable precursor)
    • TOF (total organic fluorine)
  • terenske metode:
    • kolori/fluorimetrične
    • elektorkemični senzorji

Najpogosteje se za določanje PFAS uporabljajo kromatografske metode, predvsem LC-MS. Slednja ima sicer nizek nivo detekcije (1 ng/L) za mnoge PFAS, a je draga in zaradi potovanja vzorca do laboratorija lahko traja dlje. Tako se pojavlja potreba po načinu določanja PFAS, ki je hitro, zanesljivo in učinkovito [3,4].

Inovativna ideja FluoroLoop

Ideja projekta FluoroLoop je izgradnja biosenzorja na osnovi aptamerov, ki bi omogočal hitro in zanesljivo testiranje PFAS v vodi. Biosenzor je osnovan na tRNA-posnemajočih strukturah (TMS) z aptamerom, specifičnim za perfluorooktanojsko kislino (PFOA). TMS so regulatorji izražanja proteinov – ti. RNA-stikala, ki bi jih lahko uporabljali tudi za zaznavo drugih problematičnih okoljskih onesnaževalcev. Prednost TMS pred drugimi podobnimi regulatorji je v njihovi raznolikosti in modularnosti – omogočajo pester nabor sprememb ter tako prilagodljivost na nabor različnih vhodnih signalov (RNA, majhne molekule, proteini)[3].

TMS (ang. "tRNA-mimicking structures")

TMS oziroma tRNA-posnemajoče strukture predstavljajo novo možnost regulacije izražanja proteinov – temeljijo na metazojski mitohondrijski tRNA in v strukturi vsebujejo tri module (za projekt sta pomembni predvsem zanka D in represorska domena). V principu delujejo tako, da se vežejo na začetek in konec zaporedja RBS na mRNA, s čimer onemogočijo vezavo ribosoma in s tem translacijo. Z dodatkom aptamernih zaporedij v zanko D vezavo TMS na mRNA povežemo s prisotnostjo določenega liganda, kar je tudi osnovna ideja projekta. Zanka D je namreč pomembna za ustrezno 3D strukturo molekule – ob vezavi liganda se ta struktura poruši in TMS ni več sposobna vezave na mRNA, kar omogoči izražanje proteina. Inhibicija delovanja TMS je odvisna od koncentracije prisotnega liganda. Sistem omogoča zlahka prilagodljivo potencialno biokocko, ki lahko detektira vsako molekulo, za katero obstaja aptamer [3,5].

Izvedba projekta FluoroLoop

Projekt so začeli z validacijo TMS, kjer so – poleg začetnih eksperimentov – testirali nekatere že poznane aptamere – specifično dve verziji manganovega aptamera in dve verziji teofilinskega aptamera, s čimer so preverjali odvisnost delovanja TMS od liganda. Predhodno odkrite, PFOA specifične aptamere so poskušali optimizirati ter karakterizirati, a pri delu niso bili uspešni. Za namen projekta so tako uporabili aptamer iz referenčnega članka [6]. Optimizirali so njegovo dolžino ter ohranili zgolj nujni del za vstavitev v zanko D izbrane TMS – osrednji del pripravljenega biosenzorja. Poleg in vitro validacije, si je ekipa zadala tudi oblikovanje bioinformatskega orodja, ki bi omogočalo načrtovanje in optimizacijo aptamerov s povezovanjem različnih orodij za molekulsko modeliranje [3].

Validacija regulacijskega sistema TMS

Za potrebe testa PFOA je morala skupina najprej vzpostaviti biosenzor. TMS iz članka, ki je prvotno definiral možnost uporabe TMS za regulacijo izražanja [5] so povezali z izražanjem fluorescirajočega proteina – v njihovem primeru GFP ter mCherry. Slednja omogočata preprosto detekcijo brez dodatnih korakov celične lize. Ustrezne plazmide za prenos v celice je ekipa zgradila s kloniranjem USER (Uracil Specific Excision Reagent). Slednje je osnovano na metodi PCR in tehnologiji kloniranja brez ligacije, ki omogoča sintezo plazmida z več inserti v enem koraku. Najprej željene dele pomnožimo s PCR, pri katerem uporabljamo posebej oblikovane začetne oligonukleotide, ki na 5' koncu dodajo podaljše z enim dU – delo poteka z uracil kompatibilno polimerazo (npr. X7). Produkte PCR očistimo in obdelamo z reagentom USER. Reakcija vključuje izrez podaljškov z uracilom s sledečo hibridizacijo specifičnih lepljivih koncev – slednji so lahko oblikovani različno, kar omogoča kreacijo različnih komplementarnih previsov. Skupina je pridobljene produkte klonirala v DH5alfa E. coli. Po propagaciji v bakterijah, čiščenju in validaciji s PCR ter Sanger sekvenciranju, so plazmide kotransformirali v E. coli BL21(DE3) za izražanje proteina. Sev je bil izbran zaradi vsebnosti IPTG inducibilne T7 polimeraze. Seve so inkubirali preko noči, reinokulirali in inducirali v pozni fazi log. 5 ur po indukciji so izmerili fluorescenco in z rezultati ugotvaljali uspešnost represije fluorescirajočega proteina – mCherry [3,7]. Za zmanjšanje tveganja, da bo manj molekul TMS kot transkriptov za utišanje, je skupina izražala regulator TMS v plazmidu z velikim številom kopij, medtem ko so bili reporterski geni vstavljeni v plazmid z majhnim številom kopij. Posledično so dobili veliko večje število represorjev kot mRNA za utišanje, kar je izboljšalo puščanje sistema [3]. Za validacijo so izvedli dva sklopa eksperimentov, opisana v nadaljevanju.

Opravili so dva sklopa eksperimentov.

Izražanje mCherry v odvisnosti od GFP

Sistem potrebuje tri komponente, od katerih je vsaka inducibilno regulirana – izražanje GFP, ki bo deloval kot ligand za TMS, ki bi se sicer vezala na mRNA zapis za protein mCherry. GFP je bil induciran z anhidrotetraciklinom, mCherry z L-arabinozo in TMS z IPTG. Brez izražanja GFP bi TMS zavrla izražanje mCherry – ne bi opazili fluorescence. Ob izražanju GFP se bi ta povezal s TMS, spremenil njegovo strukturo in onemogočil vezavo na transkript mRNA. Opaziti bi morali fluorescenco, kar so uspešno potrdili tudi rezultati skupine [3].

Izražanje mCherry v odvisnosti od drugih ligandov

Prvotni eksperiment z GFP in mCherry so modificirali za testiranje prilagoditve odvisnosti liganda z zamenjavo aptamera. Tako so v dano TMS vstavili že znana aptamerna zaporedja za mangan (dve zaporedji) in teofilin (dve zaporedji). Metoda bi morala še vedno delovati po istem načelu: v kolikor ni prisotnega vezanega liganda, se TMS poveže okoli RBS in prepreči izražanje mCherry. Ob prisotnosti ustreznega liganda TMS zaradi strukturnih ovir ni sposobna vezave in protein se prosto izraža. Rezultati so sledili postavljeni hipotezi, ob večjih koncentracijah liganda so zaznali manjšo fluorescenco [3].

Karakterizacija aptamera PFOA

V letu 2022 je bil obljavljen članek, ki je določil ssDNA aptamer z zmožnostjo vezave PFOA. Določili so ga z uporabo metode SELEX, kjer so pridobili deset različnih ssDNA z zmožnostjo vezave PFOA – in silico so analizirali sekundarne strukture zaporedij in odkrili tri regije ohranjene med več aptameri. S testom fluorescence so ocenili vezavne afinitete aptamerov z vezavo fluorofora na aptamer in utiševalca na vezavno verigo. Najboljši aptamer je PFOA vezal z disociacijsko konstanto KD 5,5 uM v čisti raztopini in 7,4 uM v odpadni vodi. Končna verzija aptamera je imela nivo detekcije 0,17 uM v vodi. Ker je delo s ssDNA zahtevno, je skupina testirala potencialno preoblikovanje v ssRNA, ob čemer so testirali vezavno afiniteto PFOA na več verzij aptamerov [6]. Za izvedbo eksperimenta so predvideli dve možnosti: ITC (ang. »Isothermal Titration Calorimetry«) in SPR (ang. »Surface Plasmon Resonance«). Obe metodi se uporabljata za določitev vezavne afinitete, a ITC potrebuje obiširne eksperimente za določitev ustreznih reakcijskih pogojev. SPR je za izvedbo prav tako zahtevna tehnika, ki jo je skupina izvedla v sodelovanju s Centrom za diagnostiko. Prvotni eksperimenti so generirali večje število lažnih pozitivnih rezultatov, za kar so ponudili več razlogov: vezava PFOA na ploščo, koagulacija PFOA ali neustrezna regeneracija plošče po vsakem testu. Tako aptamerov, specifičnih za PFOA, (zaenkrat) niso karakterizirali in/ali optimizirali. Za potrebe nadaljevanja projekta so uporabili najbolj usrezni aptamer, določen v članku [6].

Konstrukcija PFOA-odzivnega sistema TMS

Iz izhodiščnega TMS so pripravili tri variacije različnimi dolžinami debel. Glede na predvideno sekundarno strukturo osnovnega aptamera – ohranene dele in dele pomembne za vezavo fluoroforjev – so iterativno odstranjevali dele zaporedja, s čimer so testirali efekt debel. Najprej so odstranili nukleotide, potrebne za vezavo fluoroforjev, nato neohranjene regije. Pripravljena zaporedja vstavili v TMS. Testirali so jih za od PFOA odvisno inhibicijo izražanja reporterja ter nazadnje obdržali zgolj ohranjene regije z ohranjenimi zankastimi strukturami, ki predstavljajo zgolj 19 bp prvotnega aptamera. Sicer so rezultati za vse aptamere pokazali zmanjšanje fluorescence [3].

Perspektiva za prihodnost

Biokocka TMS, pripravljena v sklopu projekta, kaže od liganda odvisno inhibicijo translacije proteinov, kar nakazuje na nov mehanistični model struktur TMS. Pripravljene TMS kažejo od koncentracije odvisno inhibitorno odvisnost, katere specifičnost je odnisna od vstavljenega aptamernega zaporedja [3]. Molekula liganda se veže na zanko D v TMS, nato se celoten kompleks skupaj veže na reportersko mRNA. Prisotnost liganda med translacijo vodi v zmanjšanje fluorescence. Biosistem ima potencial za modularnost in tarčenje tudi drugih okoljskih onesnaževalcev [3]. Čeprav je bila stvaritev različnih od liganda odvisnih TMS v osnovi uspešna, se opazovani TMS ne obnašajo v skladu s prvotnimi pričakovanji. Faktorji, ki bi lahko dodatno vplivali na reproduktibilnost so pH, raztopljeni ioni in spremembe v površinski napetosti. Za natančno določitev mehanizma delovanja TMS so potrebni nadaljnji poskusi [3].

Programska opera AptaLoop=

Običajno aptamere pridobivamo z zahtevnim in časovno potratnim procesom SELEX, ki poleg že naštetih slabosti ne zagotavlja najdbe najbolj ustreznega aptamera. Metodo bi lahko izboljšali z vzpostavitvijo orodij predvidevanja, ki bi z racionalnim pristopom določili najbolj efektivno aptamerno sekvenco za dani ligand. Predhodne skupine iGEM so že vzpostavile metodi za tvorbo aptamerov brez SELEX (MAWS) leta 2015 z optimizacijo 2017. MAWS uporablja kriterij entropije za progresivno selekcijo baz za in silico predvidevanje aptamerov. Naše razumevanje konformacijskih sprememb aptamera ob vezavi liganda je še vedno omejeno, a ključno za koherentno karakterizacijo obnašanja znotrajceličnih aptamerov in izboljšanje modelov [3]. Cilj ekipe je bil združiti glavne metode in silico aptamerne dinamike, kot so zlaganje, sidranje ter molekulska dinamika, v en, uporabniku prijazen program. Prav tako so želeli izboljšati software MAWS z posodobitvijo kode ter dodatkom novih funkcij [3]. AptaLoop sestavljajo štirje moduli, ki uporabniku omogočajo oblikovanje DNA ali RNA aptamerov za targetiranje specifične molekule, predvidevanje sekundarne ali terciarne strukture aptamera, predikcijo položaja interakcije med dvema molekulama in simulacijo molekulske dinamike. Uporabnik ima dve možnosti za uporabo AptaLoop, glede na to, ali že ima aptamerno sekvenco ali ne, ki se nekoliko razlikujeta po zaporedju korakov [3].

Literatura

[1] National Institute of Environmental Health Sciences: Perfluoroalkyl and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS). https://www.niehs.nih.gov/health/topics/agents/pfc. [2] Per- and Polyfluorinated Substances (PFAS) Factsheet | National Biomonitoring Program | CDC. https://www.cdc.gov/biomonitoring/PFAS_FactSheet.html. [3] FluoroLoop | DTU-Denmark. https://2023.igem.wiki/dtu-denmark/index.html. [4] Rehman, A. U., Crimi, M. & Andreescu, S. Current and emerging analytical techniques for the determination of PFAS in environmental samples. Trends in Environmental Analytical Chemistry 37, e00198 (2023). [5] Paul, A., Warszawik, E. M., Loznik, M., Boersma, A. J. & Herrmann, A. Modular and Versatile Trans-Encoded Genetic Switches. Angewandte Chemie International Edition 59, 20328–20332 (2020). [6] Park, J., Yang, K. A., Choi, Y. & Choe, J. K. Novel ssDNA aptamer-based fluorescence sensor for perfluorooctanoic acid detection in water. Environ Int 158, 107000 (2022). [7] USER® Cloning | NEB. https://www.neb.com/en/applications/cloning-and-synthetic-biology/user-cloning.