B.HOME

B. Home je projekt ekipe iz Fudana, ki je leta 2023 tekmovala na iGEM sinteznem tekmovanju. Razvili so biofilm, ki posnema simbiotski odnos med cianobakterijami in Escherichio coli, ter ga prilagodili, da prenese hude pogoje na Marsu. S tem bi spremenili kamnine na Marsu v rodovitno zemljo, kar bi pripomoglo k ustvarjanju življenjskega habitata za človeštvo [1]. Predstavitev projekta je dostopna na povezavi: https://2023.igem.wiki/fudan/

Avtorica povzetka: Luša Karner

Uvod

Z naraščajočimi ekološkimi in demografskimi krizami, kolonizacija planetov predstavlja eno izmed rešitev za prihodnost človeštva. Mars izstopa kot najbolj obetaven kandidat, saj so njegove značilnosti najbolj podobne tistim na Zemlji. Vendar pa je površje Marsa večinoma pusta pokrajina, prekrita z raznimi kamninami, zato mora najprej doživeti preobrazbo tal skozi postopek teraformiranja [1]. Lišaji, sestavljeni iz simbiotskih gliv in zelenih alg ali cianobakterij, so pogosto pionirska vrsta v nekem okolju. Talus lišaja raste v globino in črpa hranila. Ob tem prihaja do kemijskega in fizikalnega preperevanja kamnin. Vrh ki prepereva je narejen iz mineralnih delcev in talusa samega lišaja. Gre za organomineralen kompleks, ki razpade na majhne delce kjer se lahko pridružijo višje strukture [2]. Presajanje lišajev na Mars pa je zapleteno, predvsem zaradi izrazitih razlik v sestavi skorje in atmosferskih pogojih med dvema planetoma [1].

Problematika

Neprijazni pogoji Marsa zahtevajo, da biofilm prenese močno UV sevanje, zelo nizke temperature in sušo. Ti okoljski pogoji poganjajo tudi globalne cikle zračnih tokov in prašne nevihte, zato mora biti biofilm tudi izjemno oprijemljiv in imeti dobro strukturiran matriks. Za rast se mora zanašati na sončno energijo in atmosferske elemente. Biofilm mora imeti sposobnost izločanja snovi, ki povzročajo raztapljanje in preperevanje silikatnih in sulfatnih kamnin Marsa [1].

Rešitev

Rešitev združuje štiri medsebojno odvisne sisteme in sicer sistem za preživetje, simbiozo, tvorbo biofilma in sistem za preoblikovanje terena. V sistemu za preživetje so vpeljali modul proti UV-žarkom, modul proti zmrzali in modul proti izsušitvi. V sistemu za simbiozo so vzpostavili simbiotičen odnos med E. coli in avtotrofnimi cianobakterijami. Sistem za preoblikovanje terena pa vključitve modul EPS in modul oksalne kisline.

Sistemi za preživetje

Modul proti UV-sevanju

Da bi povečali odpornost proti UV-sevanju in omilili poškodbe biomolekul, ki jih povzroča sevanje so povečali izražanje proteinov, kot sta na primer FEN1 in XRCC1. Ti proteini delujejo tako, da pomagajo pri popravljanju napak DNA ali se vežejo na DNA, s čimer jo ščitijo pred hidroksilnimi radikali, ki jih povzroča UV-sevanje. Eksperimentalni rezultati so pokazali, da so tako modificirane E. coli pokazale višjo stopnjo preživetja kot bakterije divjega tipa, kar kaže na izboljšano UV toleranco E. coli so prav tako dodali sposobnost izločanja Mycosporine-like amino acids (MAAs), ki absorbirajo UV-žarke in deluje kot zaščita.

Modul proti zmrzali

Protein proti zmrzovanju Ammopiptanthus nanus (AnAFP) so dodali v E. coli, da bi zaščitil stabilnost membranskih struktur v hladnih razmerah, saj preprečuje strjevanje makromolekul in ima regulatorno vlogo z vezavo na kalcijeve ione. E. coli, ki izraža AnAFP, je pokazala višjo stopnjo preživetja, kar kaže, da izražanje AnAFP omogoča protizmrzovalno sposobnost in preživetje pri 0 stopinjah za daljši čas.

Modul proti izsušitvi

Da bo sistem bolj odporen na pomanjkanje vode, so dodali zapis za izražanje dveh ključnih proteinov in sicer SAHS in mtSSB. SAHS 33020 ali znan tudi kot tardigrade intrinsically disordered protein (TDP), ki ob izsušitvi tvori nekristalinično amorfneo trdno matriko, ki je sposobna zaščititi druge občutljive biološke komponente. Hypsibius exemplaris mtSSB je mitohondrijski protein, ki se nespecifično veže na enoverižno DNA. Tako ovita DNA je fizično zaščitena pred poškodbami. V težkih pogojih, kot so izsušitev, vročina in sevanje, lahko ohranja stabilnost DNA in poveča stopnjo preživetja organizmov v neugodnih okoljih. Ko sta H. ex mtSSB in SAHS sočasno izražena, E. coli kaže višjo stopnjo preživetja med izsušitvijo v primerjavi z E. coli, ki izraža ta dva proteina posamično.

Simbiotičen sistem

V simbiotičnem sistemu delujejo cianobakterije Synechococcus elongates kot fiksatorji ogljika, gensko modificirane E.coli pa imajo vlogo potrošnika in nosilca omenjenih funkcij. V cianobakterije so vključili gen saharozne permeaze (CscB), ki kodira kanal za boljše izločanje saharoze. V E. coli so pa vključili encim fruktofuranozidazo (SacC), ki spodbudi hidrolizo saharoze v fruktozo in glukozo. S tem se izboljša absorpcija in izkoriščanje saharoze kot ogljikovega vira. E. coli, ki izraža SacC, je pokazala podobne rastne vzorce kot E. Coli divjega tipa, ki kot vir ogljika izrablja glukozo, kar kaže na njihovo učinkovito izrabo saharoze.

Sistem za tvorbo biofilma

Cilj sistema je vzpostaviti močan fizični stik med cianobakterijami in E. coli, ustvariti stabilno podlogo ter dodatno okrepiti odpornost proti okoljskim dejavnikom. Oblikovali so sistem z dvema ključnima komponentama. Prva vključuje izražanje antigena in nanotelesa (Ag/Nb) na zunanji membrani preko intimina, kar povzroča spontano adhezijo sevov E. coli med seboj. Druga komponenta vključuje specifičen lektin LCA, ki povzroča fuzijo intimina in lektina ter adhezijo med cianobakterijami in E. coli. Rezultati eksperimentov so pokazali zmanjšano število prisotnih bakterij v supernatantu po določenem času, zato lahko sklepamo da ta sistem posreduje specifično vezavo med E. coli in cianobakterijami ter s tem spodbuja proces nastajanja biofilma.

EPS modul

Eksopolisaharidi (EPS) povečajo površinsko adhezijo preko interakcij med funkcionalnimi skupinami. Spodbujanja agregacijo in stabilizacijo prahu na površini Marsa, kar prispeva k izboljšani stabilnosti in plodnosti tal. Pri tem so morali optimizirati izražanje ključnih encimov galU in pgmA v biosintetični poti za povečanje proizvodnje EPS. Bakterije, ki izražajo EPS so postale "težje" in "bolj lepljive", kar je posledično spodbudilo tvorbo skupkov.

Modul oksalne kisline

Oksalna kislina, ki jo izločajo pionirske rastline, kot so lišaji, igra ključno vlogo v geokemičnem procesu razpadanja kamnin in tvorbi zemlje. Ta kislina tvori kation-organske komplekse z mineralnimi kationi, kar povzroči prenos gostote elektronov, s čimer pospešuje mineralno hidrolizo.ObcA je eden od genov, potrebnih za sintezo oksalne kisline, ki lahko skupaj z ObcB katalizira oksaloocetno kislino (OAA) in citronsko kislino, da nastane oksalna kislina (OA).

Delovanje

Biofilm bi razpršili na površje Marsa. Ta se bo hitro razširil z razmnoževanjem bakterij in prekril gole skale. Cianobakterije bodo izkoristile atmosferski CO2 za vir energije in s fotosintezo bodo proizvajale organske snovi. Zaradi tega bi biofilm lahko stalno rasel na Marsu brez dodatne podpore. Zaradi hude suše na površju Marsa pa je za uspešno naselitev biofilma potreben vir vode. Za to bi zbrali obilne količine ledu na Marsu, ga raztopili s pomočjo grelnikov in nato razpršili vodo po biofilmu. Približno 24 ur po zagotovitvi vodnega vira bi pričele E. coli stimulirati funkcijo lišajev s sekrecijo oksalne kisline in zunajceličnih polisaharidov (EPS). Gole skale na površju Marsa bi se postopoma razgradile v majhne koščke gramoza in nato v prah. Z EPS se bo prah zgostil in na koncu oblikoval rodovitna tla.

Implementacija sistema

Kljub temu da je bil produkt zasnovan za pospešitev preoblikovanja površja Marsa, ima poleg tega tudi potencialne aplikacije na Zemlji in s tem okoljsko in komercialno vrednost. Proizvodnja oksalne kisline bi lahko bila uporabljena za reševanje salinizacije tal in bi postopoma izboljšala slana tla. Uporaba mikrobnega EPS za izboljšanje tal lahko naredi tla bolj zračna in prepustna, kar bo koristno za pridelavo poljščin. Nizke temperature lahko povzročijo, da poljščine utrpijo škodo zaradi mraza, zato bi biološka zaščita pred mrazom lahko bila koristna. Protein proti izsušitvi lahko poveča zadrževanje vode in močno izboljša okrevanje po suši, kar bi lahko izboljšalo pridelavo poljščin v sušnih območjih. Na UV-odporne snovi MAAs, pridobljene iz bioloških virov, bi lahko odprle pot za proizvodnjo okolju prijaznih krem za zaščito pred UV-žarki.

Oblikovanje sistema

Za izrezovanje policistronskih mRNA so uporabili ribocim hammerhead in na podlagi te funkcionalnosti izdelali sistem za policistronsko koekspresijo, ki ga podpira ribocim: pRAP. Glavni problem policistronskih vektorjev, ki vsebujejo dva ali več ciljnih genov pod enim promotorjem je bistveno nižja ekspresija spodnjih genov v primerjavi z genom poleg promotorja. V sistemu pRAP se RNA zaporedje ribocima samo razcepi, kar povzroči, da se policistronski mRNA transkript posttranskripcijsko pretvori v posamezne monocistrone in vivo. V sistemu pRAP sta dva regulatorna elementa: RBS in lasnična zanka. RBS vpliva na hitrost začetka prevajanja , saj vpliva na vezavo ribosoma na mRNA, kar posledično vpliva na koncentracijo proteina. Lasnična zanka vpliva na koncentracijo proteina z uravnavanjem hitrosti razgradnje mRNA. Z uravnavanjem teh dveh regulatornih elementov lahko nadzorujemo ekspresijo proteinov. Poleg tega so razvili programsko orodje za kvantitativno načrtovanje pRAP sistema, ki pokriva vse možne regulatorne elemente in v celoti podpira cikel Načrtuj-Zgradi-Testiraj-Nauči (DBTL).

Zaključek

Ustvarjen biofilm kaže izjemno odpornost na ekstremne pogoje, kar vključuje UV-sevanje, zmrzovanje in izsušitev. Dosegel je avtotrofno preživetje, kar zagotavlja temelj za trajnostne ekosisteme. Poleg tega vzpostavi trden fizični okvir, ki spodbuja izmenjavo hranil in olajša širjenje, kar je ključno za preoblikovanja terena. Ima tudi sposobnost sinteze oksalne kisline, ki pospešuje geološko razpadanje kamnin. Trdno se prilepi na marsovsko površje preko EPS, kar izboljša njegovo stabilnost in funkcionalnost. Za vpeljavo heterolognih genov v E. coli so uporabili ribocim, ki se je izkazal za zelo učinkovitega. To je ključnega pomena pri doseganju vseh zgoraj omenjenih funkcionalnosti.

Viri

(1) https://2023.igem.wiki/fudan/description/#inspiration (2) https://sl.wikipedia.org/wiki/Li%C5%A1aj