Uporaba konzorcija kvasovk za de novo biosintezo rastlinskih lignanov

Izhodiščni članek: De novo biosynthesis of plant lignans by synthetic yeast consortia

Uvod

V rastlinah poteka sinteza kompleksnih naravnih produktov, kot so npr. lignani. Ta se zgodi preko porazdelitve nalog in prenosa metabolitov med različnimi celicami, tkivi, organi in celičnimi organeli. Zato bi lahko gradnja mikrobnih konzorcijev, ki sodelujejo na podoben način kot rastlinske celice, razširila presnovne zmogljivosti in omogočila sintezo bolj kompleksnih spojin. Mikrobni konzorciji so sistemi, sestavljeni iz dveh ali več mikrobnih populacij (lahko medvrstno ali znotraj ene vrste), ki so razširjeni in naravno prisotni v okolju [1].

Lignani so skupina naravnih produktov z zapletenimi strukturami in raznolikimi biološkimi učinki, kot so protitumorski, antioksidativni, antibakterijski in protivirusni učinki [2]. V rastlinah se biosinteza vseh lignanov začne z elektronsko sklopitveno reakcijo dveh molekul koniferil alkohola, ki izvirata iz aromatskih kislin. Raznolike strukture lignanov pa nadalje nastanejo s pomočjo specifičnih encimov, kot so lakaza (Lac), pinorezinol-laricirezinol reduktaza (PLR), citokrom P450 monooksigenaza (Cyp) in uridin difosfat (UDP) glukoziltransferaza (UGT). Zato je sinteza koniferil alkohola, skupnega prekurzorja vseh lignanov, ključni predpogoj za proizvodnjo kompleksnih lignanov v mikroorganizmih [1].

V tej študiji so se osredotočili na rekonstrukcijo biosinteze lignanov v kvasovkah, vendar je ta zahtevna in pogosto vodi do nespecifičnosti metabolnih poti, kar negativno vpliva na učinkovitost biosinteze. Namreč, sinteza lignanov v rastlinah poteka z medceličnim in medorganelnim sodelovanjem, kar pomaga zmanjšati pojav stranskih reakcij. Pri de novo sintezi lignanov v heterolognih mikroorganizmih, kot je Saccharomyces cerevisiae, pa je preprečevanje presnovne nespecifičnosti izredno kompleksno. Zlasti zaporedni intermediati – p-kumarinska kislina, kavna kislina in ferulinska kislina – imajo zelo podobne strukture in se lahko zlahka pretvorijo v stranske produkte po nespecifičnih poteh, kar oslabi sintezo koniferil alkohola [1].

Zaradi tega so biosintetsko pot razdelili med konzorcij kvasovk, zgrajenih na osnovi mutualizma, pri čemer so za presnovni most uporabili ferulinsko kislino. Takšen soodvisen sistem uspešno premaga presnovno nespecifičnost in omogoči sintezo skupnega prekurzorja, ki je koniferil alkohol. Nadalje so dosegli še de novo sintezo dveh ključnih gradnikov lignanov, pinorezinola in lariciresinola. Na koncu pa so razširili zmogljivost sistema z biosintezo kompleksnih lignanov [1].

Biosinteza koniferil alkohola v kvasovkah

Koniferil alkohol je neposredni prekurzor vseh lignanov in ga zaradi zapletene presnovne poti ni mogoče selektivno sintetizirati. Za raziskavo najboljše poti sinteze koniferil alkohola v Saccharomyces cerevisiae so kot substrati uporabili tri aromatične kisline (p-kumarinsko, kavno in ferulinsko kislino) ter testirali tristopenjske encimske kombinacije t. i aromatskega alkoholnega modula. Ta je bil sestavljen iz 4-kumarat koencim A ligaze (4Cl), cinamoil-CoA reduktaze (CCR) in alkoholne dehidrogenaze (Adh6), da bi sintetizirali ustrezni aromatski alkohol [1].

Rezultati so pokazali, da je ferulinska kislina najboljši substrat za sintezo koniferil alkohola v S. cerevisiae. Dodajanje ferulične kisline je privedlo do učinkovite pretvorbe v koniferil alkohol s strani sevov, ki so vsebovali različne kombinacije encimov. Najboljši sev je bil RB57, ki izraža gene Ptr4CL5, PtrCCR2 (oba iz P. trichocarpa) in ADH6 (iz S. cerevisiae) [1].

Zaradi ugotovitev o uspešni pretvorbi ferulinske kisline v koniferil alkohol so gene za aromatični alkoholni modul (Ptr4CL5, PtrCCR2 in ADH6) uvedli v sev, ki proizvaja ferulinsko kislino RB79 (bil prej že konstruiran). Tako so dobili na novo pripravljen sev RB124, ki pa ni uspel proizvesti koniferil alkohola. To nakazuje na to, da so neznane stranske reakcije tekmovale za prekurzorje in blokirale presnovno pot ferulinske kisline in posledično koniferil alkohola. Glede na široko substratno specifičnost rastlinskega encima 4Cl so domnevali, da lahko Ptr4CL5 pretvori p-kumarinsko in kavno kislino v njune derivate še preden bi se ti spojini lahko pretvorili v ferulinsko kislino [1].

Ker vsi trije testirani kandidati za 4Cl encime v tej študiji lahko reagirajo s p-kumarinsko, kavno in ferulinsko kislino so zasnovali dvokvasni konzorcijski sistem za biosintezo koniferil alkohola, v katerem so biosintezno pot razdelili na stopnji sinteze ferulinske kisline. S tem so želeli zmanjšati število stranskih reakcij. Opazili so, da je bila ferulinska kislina učinkovito izločena v gojišče s strani seva RB218, ki proizvaja ferulinsko kislino, ter da je bila dodana ferulinska kislina učinkovito sprejeta in uporabljena za biosintezo koniferil alkohola (v sevu RB57). Tako so ob so-gojenju seva RB218 in seva RB57 (z encimi za aromatični alkoholni modul) zaznali de novo biosintezo koniferil alkohola, kar dokazuje, da je konstrukcija mikrobnih konzorcijev učinkovita strategija za zmanjšanje stranskih reakcij. Vendar pa nihanje v donosnosti (z 52,4-% odstopanjem) kaže, da je za doseganje učinkovite in stabilne biosinteze potrebno vzpostaviti bolj stabilen konzorcij [1].

Biosinteza pinorezinola in lariciresinola v kvasovkah

Glede na to, da sta pinorezinol in lariciresinol ključni ogrodji za številne kompleksne lignine, so poskušali identificirati nadaljne poti za njuno sintezo na podlagi de novo sinteze koniferil alkohola v kvasovkah. Za poenostavitev eksperimenta so dodajali ferulinsko kislino, ki je pospešila raziskovanje in vzpostavitev biosinteznih poti. Biosintezna pot, ki se uporablja za ustvarjanje enostavnih lignanov (pinorezinol, laricirezinol in sekoizolariciresinol) iz koniferilnega alkohola, vključuje tri encimske reakcije, ki jih katalizirajo encimi Lac/Pex, Dir in Plr [1].

Prvi korak je reakcija spajanja fenoksi radikala s koniferil alkoholom, kar ustvari prvo lignansko molekulo pinorezinol. To lahko katalizirata dve različni družini encimov, Lac in Pex. Lac prenaša elektrone iz substratov (koniferil alkohol v tej študiji) na O2 in proizvaja H2O in ustrezne produkte prostih radikalov (koniferil alkohol v tej študiji). Zato so izrazili dva gena LAC, TsLAC3 iz in TvLAC1, ki so bili identificirani kot encimi z relativno visokim redoks potencialom in visoko oksidativno sposobnostjo v glivah. Glede na to, da je tudi družina peroksidaz Pex B vključena v spajanje koniferilnega alkohola, so bili v PeroxiBase najdeni štirje geni PEX in izraženi za sintezo pinorezinola. Na žalost pinorezinol ni bil uspešno sintetiziran med nobenim od teh poskusov. Očitno je vso ferulinsko kislino zaužil sev RB69, ki izraža TsLAC3, kar kaže, da je bil TsLAC3 funkcionalen pri kataliziranju ferulinske kisline [1].

PLR je od NADPH odvisen encim, ki pretvori pinorezinol v sekoizolaricirezinol preko lariciresinola z uporabo zaporednih dvostopenjskih reakcij. Monofunkcionalni Plr (AtPrr1) katalizira prvo stopnjo reakcije s pinorezinolom in ne kaže afinitete za lariciresinol. Ugotovljeno je pa bilo, da IiPLR1 kodira encim z dvostopenjskim katalitičnim delovanjem, kljub temu da ima zelo šibko katalitično aktivnost do lariciresinola. Zaradi tega so bili izraženi: gen AtPRR1 (ki kodira A. thaliana Plr 1) in dva gena PLR (IiPLR1 in ShPLR1). Vsi ti encimi so uspešno proizvedli lariciresinol v S. cerevisiae. Seva XH2B1 in XH2B2, ki sta izražala IiPLR1 sta proizvedla najvišje titre lariciresinola, vključno s skoraj enakima količinama (-)- in (+)-lariciresinola. Poleg tega so bile v sevu XH2B2 odkrite količine produkta drugega koraka, sekoizolaricirezinola, kar kaže na to, da IiPlr1 deluje pri kataliziranju dvostopenjske reakcije v smeri njegove biosinteze. Tako so skonstruirali učinkovito pot za sintezo pinorezinola in lariciresinola v kvasovkah, ki bo zagotovila osnovo za nadaljnjo širitev heterologne sinteze lignanov z raznoliko strukturo [1].

Biosinteza kompleksnih lignanskih glukozidov v kvasovkah

Nato so poskušali sintetizirati lariciresinol diglukozid (LDG), protivirusno komponento korenine I. indigotica [1]. LDG, znan tudi kot klemastanin B, izkazuje protivirusno delovanje proti gripi, saj zavira razmnoževanje virusa, preprečuje njegovo pritrjevanje na celice in deluje kot profilaktično sredstvo [3]. Da bi omogočili biosintezo lignanskih glukozidov v kvasovkah, so tri predhodno identificirane gene UGT I. indigotica (IiUGT71B2, IiUGT71B5a in IiUGT71B5b) integrirali v sev XH2B2, ki proizvaja lariciresinol. Zanimivo je, da je za razliko od in vitro samo IiUgt71b5b (XH12) lahko sintetiziral LDG, ko je bil hranjen s 100 mg/l ferulinske kisline. Na koncu so z prekomerno ekspresijo IiUGT71B5b v sevu XH18 in izboljšanju prekurzorja UDP-glukoze močno izboljšali proizvodnjo LDG [1].

Biosinteza lignanskih glukozidov s konzorciji kvasovk

Nazadnje so izdelali konzorcij kvasovk za de novo sintezo protivirusnega LDG, ki je zagotovil koristen simbiotski sistem za ublažitev presnovne promiskuitete v spodnji biosintetski poti fenolnih kislin. Celotna pot za sintezo LDG je bila razdeljena in uvedena v naslednje mutante: eden, v katerem je bila predhodno zgrajena biosintezna pot ferulinske kisline (sev RB218), in drugi, v katerem so bili izraženi vsi identificirani geni, vključeni v pretvorbo ferulinske kisline v LDG (sev XH12). V tem sistemu ferulinska kislina deluje kot most med obema segmentoma poti za de novo sintezo, medtem ko poti metionina, adenozina in sorodnih presnovkov delujejo kot hranila za obvezno medsebojno delovanje [1].

Zaključek

Če povzamemo, je ta študija izkoristila de novo sintezo kompleksnih lignanov kot primer za dokazovanje, da lahko konzorcij kvasovk posnema večcelične rastlinske organizme za izvajanje delitve dela in ublažitev presnovne nespecifičnosti. Ta sistem je mogoče uporabiti za izboljšanje sinteze kompleksnih naravnih proizvodov in celo drugih kompleksnih bioloških funkcij, ki zahtevajo sodelovanje s kvasovkami. Rezultati študije predstavljajo temelj za razvoj heterologne biosinteze lignanov.

Literatura

[1] Chen, R. et al.,De novo biosynthesis of plant lignans by synthetic yeast consortia Nature Chemical Biology, 21, 456–465,2025, doi: https://doi.org/10.1038/s41589-025-01861-z. [2] Zhang, Y. et al.,Review of lignans from 2019 to 2021: Newly reported structures and bioactivities, Phytochemistry, vol.203,113412, 2022, doi: https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2022.113412 [3] MedChemExpress. Clemastanin B. Accessed: Apr. 19, 2025. [Online]. Available: https://www.medchemexpress.com/clemastanin-b.html