Povezava sintezne in sistemske biologije za in vivo encimatiko

Izhodiščni članek: Combining systems and synthetic biology for in vivo enzymology

Uvod

Določanje kinetičnih parametrov encimov najpogosteje temelji na merjenju reakcijske hitrosti ob spreminjanju koncentracije substrata. Pri tem razpon koncentracij substrata običajno obsega vsaj 2 velikostna reda. Na ta način je mogoče določiti afiniteto encima do substrata, ki jo opredeljuje Michaelis-Mentenina konstanta (K_M) in aktivnost encima, ki jo določata maksimalna reakcijska hitrost (v_max) in pretvorbeno število (k_cat). Klasičen pristop določanja kinetičnih parametrov vključuje izvedbo reakcije v in vitro pogojih, ki se močno razlikujejo od tistih v notranjosti celice. Namesto heterogene in nagnetene raztopine različnih makromolekul in organelov se reakcije običajno izvaja na (delno) čistih proteinskih vzorcih, ki so del razredčene puferske raztopine. Poleg tega v celicah razmejitve in kompartmentalizcija vplivajo na variacije v koncentraciji substrata, produkta in spremembe difuzijskih koeficientov. Problem predstavlja tudi in vitro študij membranskih in multimernih proteinov. Običajno jih je zahtevno očistiti, optimizacija testov aktivnosti pa je kompleksna, saj pogosto zahteva prisotnost umetnih membran. Pogoste so tudi razlike med rezultati pridobljenimi v sistemih, kjer se substrat dodaja v reakcijsko mešanico v primerjavi s tistimi pri katerih je substrat pridobljen iz metabolizma [1].

Karotenoidna sintezna pot

Razumevanje encimske kinetike je pomembno za celostno razumevanje metabolnih poti. Velik pomen pa ima tudi za razumevanje encimskih poti, ki se uporabljajo v industrijskih procesih. Primer takšne poti je karotenoidna sintezna pot [1]. Karotenoidna pot nativno poteka v različnih organizmih – denimo v nekaterih rastlinah, bakterijah in glivah. Številni rastlinski apokarotenoidi, ki so produkt encimskih cepitev karotenoidov, obsegajo pigmente, arome in spojine z vonjem, ki se pogosto uporabljajo v prehranski industriji [2]. V kvasovki Saccharomyces cerevisiae nativno ne poteka je pa sintetična pot v tej industrijsko pomembni biotehnološki šasiji zanimiva na področjih vse od proizvodnje hrane do zdravil [1]. Številni encimi udeleženi v karotenoidno pot so povezani z membrano (ang. membrane-associated), kar otežuje študij kinetike pripadajočih reakcij. Dva izmed encimov pri katerih je študij v in vitro pogojih otežen sta fitoen sintaza (CrtB; EC 2.5.1.32) in fitoen desaturaza (CrtI; EC 1.3.99.31). Fitoen sintaza je prvi encim sintetične poti in hkrati encim, ki predstavlja ozko grlo v sintezi karotenoidov v rastlinah. Encim katalizira kondenzacijo 2 molekul geranilgeranil pirofosfata (GGPP), ki sta obrnjeni ena proti drugi (ang. head-to-head), pri čemer nastane fitoen. Sintezi fitoena sledijo tri nenasičenja, rezultat katerih je molekula likopena. Pri rastlinah in cianobakterijah so v pretvorbo udeleženi štirje encimi, pri nefotosintetskih bakterijah in glivah pa le en - fitoen deasturaza [1, 2].

Zasnova in namen

Castaño-Cerezo et al so za razvoj novega sistema za in vivo encimatiko posegli po orodjih sintezne in sistemske biologije. Sintezno biologijo so uporabili za namen spreminjanja moči promotorjev in števila kopij zapisov za posamezne encime, kar jim je omogočilo variiranje koncentracije substrata direktno v celicah preko spreminjanja koncentracije encima udeleženega v njegovo sintezo. Sistemska biologija jim je preko integracije rezultatov genomike, proteomike in metabolomike omogočila vpogled v interakcije in celovitost procesov v bioloških sistemih [1].

Priprava sevov

Pristop so uporabili za študij sintetične karotenoidne poti v Saccharomyces cerevisiae. Za namen študija encimov udeleženih v karotenoidno pot so vzpostavili seve kvasovk, ki omogočajo variacijo v količini substrata GGPP. Seve pripravili s spreminjanjem CEN.PK2-1C. Pred pripravo tovrstnih sevov so sintezo GGPP povečali z upravljanjem nativne terpenske poti. Na ta način so pripravili sev yENZ15 v katerem sta zapis za farnezil pirofosfat (FPP) sintazo (ERG20) in skrajšana oblika zapisa za 3-hidroksi-3-metilglutaril-koencim A reduktazo 1 (tHMG1) močno konstitutivno izražena. Poleg tega pa vsebuje delecijo zapisa za glavno fosfatazo, ki je odstranjuje pirofosfatne skupine iz GGPP in FPP. Sledila je vzpostavitev treh različnih integracijskih kaset, ki so vsebovale različne mikrobne GGPP sintaze pod različnimi konstitutivnimi promotorji, ki so jih integrirali v genom yENZ15. Tako so proizvedli set sevov ustvarjenih za sintezo razpona koncentracij GGPP. Koncentracija GGPP je v pripravljenih sevih variirala za faktor 38, njihove hitrosti rasti so bile primerljive (0,40±0,03 h^-1), kar kaže na odsotnost sprememb v fiziologiji sevov [1].

Vsaka merjena koncentracija substrata izvira iz specifično pripravljenega seva, kjer je zapis za encim udeležen v sintezo substrata izražen na določeni ravni. Seve so nato gojili v pogojih dinamičnega ravnotežja (eksponentna rast), kjer pretok (ang. flux; analog hitrosti reakcije) in koncentracije metabolitov ostajajo konstantne. Stabilnost zaradi vzpostavljenega dinamičnega ravnotežja tako omogoča natančno meritev pretočnosti reakcije [1].

In vivo določanje parametrov za fitoen sintazo iz bakterije Pantoea ananas (PaCrtB)

Za določitev optimalne koncentracije encima za izvedbo kinetičnih testov so izvedli simulacije pri katerih so upoštevali tri različne koncentracije encima (nizko, srednjo in visoko) pri širokem razponu pretoka nastajanja produkta (ang. substrate-producing flux). Nato so analogen pristop uporabili tudi za določanje nasičenosti encima s substratom. Izbrali so tri različne konstitutivne promotorje – TEFmut2 za nizko, PGI1 za srednje in PDC1 za visoko izražanje crtB. Skladno z rezultati simulacij je koncentracija GGPP padala z višanjem aktivnosti PaCrtB, ob močnejšem izražanju PaCrtB pa je naraščal pretok nastajanja fitoena. Previsoka koncentracija PaCrtB je ovirala nasičenje encima s substratom in s tem onemogočila določitev kinetičnih parametrov. Nizka koncentracija pa je zaradi počasnega nastajanja fitoena otežila natančnost meritev, saj je bila koncentracija nastalega fitoena prenizka za natančno kvantifikacijo. Natančno meritev so dosegli le pri srednjem izražanju encima, zato so za nadaljnje meritve uporabili promotor PGI1 [1].

V vzpostavljenih sevih so dosegli 167× variacijo v koncentraciji GGPP. Dosegli so tudi delno nasičenje, kar je vodilo v nelinearen odnos med pretokom nastajanja fitoena in koncentracijo GGPP, ki je značilen tudi za klasične in vitro eksperimente. S prileganjem rezultatov na ireverzibilen Michaelis-Mentenin model so določilo natančne ocene kinetičnih parametrov K_1/2^cell (19 ± 3 µM),v_max^cell (849 ± 71 µM/h). Afiniteta PaCrtB do GGPP je bila višja od in vitro določene (K_M = 41 µM), kar kaže na pomemen določanja parametrov direktno v celicah [1, 3]. Pretvorbeno število 6 ± 1 s⁻¹, ki so ga pridobili na osnovi meritev koncentracije encima s pomočjo kvantitativne proteomike (42 nM) v sevih, kjer je PaCrtB pod kontrolo promotorja PGI1 pa je primerljiva in vitro vrednostim za encim Pantoea agglomerans [1].