Heartecho: presejalni test za raka pri pacientih po miokardnem infarktu

Projekt Heartecho [1] je na iGEM-u leta 2024 predstavila ekipa s Kitajske. Projekt je bil nagrajen z zlato medaljo in nominiran za najboljšega na področju diagnostike.

Uvod

Miokardni (srčni) infarkt in infarkt sta glavna vzroka smrti na svetu. V zadnjih letih so študije pokazale, da imajo kardiovaskularne bolezni (tudi miokardni infarkt) in rakava obolenja nekatere skupne značilnosti. Med pomembne dejavnike tveganja za obe bolezni sadajo kronično vnetje, debelost in kajenje. Klinične in epidemiološke študije so pokazale, da pri pacientih po srčnem infarktu obstaja povišano tveganje za nastanek raka [2]. Incidenca raka je pri pacientih po srčnem infarktu za kar 13 % višja kot v splošni populaciji.

Cilj

Namen projekta Heartecho je bil izdelava presejalnega testa za raka pri pacientih po miokardnem infarktu. Želeli so izdelati diagnostični test, ki bi temeljil na zaznavanju specifičnih miRNA s tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). S testom so želeli detektirati tiste miRNA, ki so visoko izražene pri pacientih s kardiovaskularnimi boleznimi in lahko hkrati spodbujajo nastanek raka. Študije so namreč pokazale, da se eksosomi, ki se ob ishemiji izločijo iz srčnih mišičnih celic, lahko nato absorbirajo v rakave celici. Ti eksosomi vsebujejo miRNA, ki v rakavih celicah zavirajo apoptozo in tako pripomorejo k napredovanju bolezni.

Načrtovanje

Izbira tarčnih miRNA

Prvi korak v načrtovanju metode je bil ugotoviti, katere miRNA izbrati za tarčo. S primerjavo podatkovnih baz GEO (Gene Expression Omnibus) in TCGA (Cancer Genome Atlas Program) so identificirali 24 miRNA, ki so drugače izražene tako po srčnem infarktu kot tudi pri raznih rakavih obolenjih. Pri izbiri kandidatov za tarčno miRNA so upoštevali še dva kriterija: količina miRNA v krvi mora biti dovolj visoka, izražanje miRNA pa mora biti povišano pri čim več tipih raka. Na podlagi teh kriterijev so nato izbrali miR-210-3p, ki se povišano izraža pri trinajstih različnih tipih raka in miR-142-3p, ki se povišano izraža pri desetih različnih tipih raka. Z analizo literature so ugotovili, da obe miRNA spodbujata migracijo in invazivnost tumorskih celic in sta tako primerna potencialna biološka označevalca. To so tudi eksperimentalno potrdili s testi celične migracije in invazije. Ker so študije pokazale, da incidenca raka ni povišana samo pri bolnikih po miokardnem infarktu, ampak tudi pri bolnikih s srčno odpovedjo, so se odločili, da na enak način analizirajo tudi izražanje miRNA pri srčni odpovedi. Identificirali so 35 različnih miRNA, ki se povišano izražajo tako pri srčni odpovedi kot tudi pri raku. Vendar pa v tem primeru niso uspeli identificirati nobene miRNA, ki bi bila izražena v zadostni količini in pri dovolj velikem številu tipov raka. Naslednji korak je bil ovrednostiti diagnostično vrednost miR-210-3p in miR-142-3p. Z analizo podatkov pridobljenih iz podatkovnih baz so ugotovili, da sočasna uporaba obeh miRNA kot bioloških označevalcev daje boljše rezultate, kot njuna posamična raba, saj zmanjša verjetnost lažno pozitivnih rezultatov.

LIRA

Za detekcijo izbranih miRNA so se odločili uporabiti tehnologijo LIRA (Loop-initiated RNA Activator). LIRA tvori sekundarno strukturo steblo-zanka, ki vsebuje prepoznavno regijo, mesto za vezavo na ribosom (RBS) in začetni kodon AUG. Prepoznavna regija je 31 nukleotidov dolgo zaporedje, ki je reverzno komplementarno tarčni RNA. 21 nukleotidov prepoznavne regije tvori zanko, medtem ko je ostalih 10 nukleotidov v steblu. V odsotnosti tarčne RNA sta RBS in začetni kodon tesno vezana v steblo in tako ne moreta sprožiti prevajanja reporterskega gena. Vezava tarčne RNA na prepoznavno regijo sproži destabilizacijo zanke, kar povzroči izpostavitev RBS-ja in začetnega kodona ter omogoči prepisovanje reporterskega gena. Za potrebe diagnostičnega testa, so LIRA zaporedje prilagodili tako, da so prepoznavno regijo zamenjali z revezno komplementarnim zapisom za miR-210-3p oziroma miR-142-3p. Ker sta bili tarčni miRNA v tem primeru krajši od 31 nukleotidov (22 in 23 nukleotidov), so morali skrajšati prepozvano regijo, pri čemer so morali upoštevati, da so izbrali pravo razmerje med številom nukleotidov prepoznavne regije v zanki in steblu. Predvidevali so namreč, da je pravo razmerje ključno za aktivnosti LIRA, saj vpliva na interakcijo s tarčno RNA. Ker so to želeli tudi eksperimentalno preveriti, so si izbrali tri različna LIRA zaporedja proti miR-210-3p z razmerji steblo/zanka 2/20, 7/15 in 10/12 ter tri zaporedja proti miR-142-3p z razmerji steblo/zanka 3/20, 8/15 in 11/12. Da bi lahko zaznali dve miRNA hkrati, so načrtali takšno strukturo LIRA, ki je vsebovala dve roki ter logična vrata IN. Vezavno mesto za eno miRNA je bilo na prvi roki, vezavno mesto za drugo miRNA pa na drugi, daljši roki, ki je bila povezana z RBS in začetnim kodonom. Pričakovali so, da se bosta slednja izpostavila zgolj ob hkratni vezavi obeh tarčnih miRNA. Z računalniškimi simulacijami so nato identificirali šest LIRA zaporedji z dvema rokama, ki so najbolje ustrezala pričakovanjem. Z analizo nekaterih značilnosti LIRA zaporedji so izmed teh identificirali tri zaporedja za katere so predvidevali, da bodo imela najboljše lastnosti.

Eksperimentalno delo

Testiranje LIRA zaporedij za detekcijo ene miRNA

Šest izbranih LIRA zaporedij so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Za povečanje izražanja so uporabili promotor T7 - tako so lahko z dodatkom IPTG nadzirali čas reakcije. Za LIRA zaporedje so dodali še zapis za izboljšan zeleni fluorescenčni protein EGFP (angl. enchanced green flourescent protein), ki je služil kot reporterski gen. Predvidevali so, da bo vezava tarčne miRNA na LIRA zaporedje sprožila izražanje EGFP. Da bi zagotovili tudi izražanje tarčnih miRNA, so zaporedji za miR-210-3p in miR-142-3p klonirali v plazmida pET-15b in pCDFDuet-1. Trije uporabljeni plazmidi imajo kompatibilna mesta začetka podvojevanja (ORI) in različne selekcijske označevalce. Tako so jih lahko hkrati transformirali v bakterijske celice ter na gojišču z določeno kombinacijo antibiotika izbrali želene kolonije. Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Celice so transformirali bodisi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem ali pa s plazmidom z LIRA zaporedjem hkrati in s plazmidom z zapisom za tarčno miRNA. Iz uspešno transformiranih kolonij so nato pripravili kulture in izolirali plazmidno DNA. Da so potrdili ustrezne velikosti plazmidov, so jih razrezali z endonukelazami in analizirali z agarozno gelsko elektroforezo. Tranformirane celice so 4 ure inkubirali z IPTG ter nato pripravili celične lizate, ki so jim izmerili fluorescenco. Značilno razliko v fluorescenci med celicami transformiranimi samo s plazmidom z LIRA zaporedjem in s celicami transformiranimi s plazmidom z LIRA zaporedjem ter plazmidom z zapisom za tarčno miRNA so opazili samo v dveh primerih. To sta bili LIRA zaporedje proti miR-210-3p z razmerjem steblo/zanka 2/20 in LIRA zaporedje proti miR-142-3p z razmerjem steblo/zanka 11/12. Rezultati kažejo, da razmerje steblo/zanka morda vendarle nima takšnega vpliva na funkcijo LIRA, kot so sprva predvidevali.

Testiranje LIRA zaporedij za hkratno detekcijo dveh miRNA

Tudi tri izbrana LIRA zaporedja z dvema rokama ki lahko hkrati vežejo obe tarčni miRNA so klonirali v plazmid pCOLADuet-1. Tudi v tem primeru s uporabili promotor T7 in EGFP kot reporterski gen. Konstrukte so označili kot LIRA1, LIRA2 in LIRA5. Plazmide so tansformirali v E. coli seva BL21-D3. Pripravili so celice, ki so vsebovale samo plazmid z izbranim LIRA zaporedjem, plazmid z LIRA zaporedjem in plazmidom za eno od tarčnih miRNA ter celice s plazmidom za LIRA zaporedje in obema plazmidoma z zapisom za tarčno miRNA. Tudi v tem primeru so celice so gojili na gojišču z dodatkom IPTG in nato pripravili celične lizate fluorescenco. Plazmidno DNA so izolirali in ustrezno velikost plazmidov potrdili z agarozno gelsko elektroforezo. Pri celicah transfromiranih z LIRA1 niso zaznali značilne razlike v fluorescenci ne glede na prisotnost katerekoli od tarčnih miRNA. Pri celicah transformiranih z LIRA2 so sicer opazili značilno povišanje fluorescence v prisotnosti obeh miRNA, vendar pa je bila fluorescenca značilno povišana tudi, kadar je bila prisotna zgolj miR-124-3p. Pri celicah transformiranih z LIRA5 so zaznali značilno povišanje fluorescence samo kadar sta bili prisotni obe tarčni miRNA, kar nakazuje, da je za aktivacijo tega LIRA zaporedja potrebna hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p.

Brezcelični sistem

Cilj projekta je bil zasnovati presejalni test za rutinsko diagnostiko. Ker bi bila transformacija miRNA iz krvi pacienta v bakterije težavna, so morali test prilagoditi za uporabo v brezceličnem sistemu. Plazmid z LIRA zaporedjem so spremenili tako, da so reporterski gen za EGFP zamenjali z LacZ, saj bi bilo v rutinskem testiranju lažje zaznati spremembo barve kot pa meriti fluorescenco. Da bi preverili, ali je uporaba testa v brezceličnem sistemu možna, so plazmid z zapisom za tarčno miRNA dodali v komercialni sistem za in-vitro prepisovanje in tako dobili tarčno miRNA. Nato so v komercialni sistem za in-vitro sintezo proteinov dodali plazmid LIRA5 z oziroma brez tarčne miRNA. Po dodatku kromogenega substrata CPRG so opazovali spremembo barve. Pri vzorcu, ki je vseboval samo plazmid z LIRA zaporedjem ni prišlo do spremembe barve. Prav tako se barva ni spremenila v vzorcih, ki sta vsebovala samo eno tarčno miRNA. V vzorcu, ki je vseboval tudi obe tarčni miRNA so opazili spremembo barve. Ta rezultat je pokazal, da hkratna prisotnost miR-210-3p in miR-142-3p aktivira LIRA5 v brezceličnem sistemu.

Zaključek

Ekipa iz Kitajske je v sklopu projekta Heartecho razvila presejalni test za odkrivanje raka pri pacientih po srčnem infarktu. Test temelji na zaznavanju miRNA miR-142-3p in miR-210-3p, ki se povišano izražata tako po miokardne infarktu kot tudi pri različnih tipih raka. Študentje so načrtali zaporedja LIRA, ki zaznavajo eno od tarčnih miRNA ter zaporedje, ki ga ajtivira hkratna prisotnost obeh tarčnih miRNA. Delovanje testa so preizkusili v laboratoriju – najprej v bakterijski kulturi nato pa še v brezceličnem sistemu. Uspešno so identificirali eno LIRA zaporedje, ki zaznava miR-210-3p, eno zaporedje, ki zaznava miR-142-3p ter zaporedje, ki zaznava hkratno prisotnost obeh miRNA.

Viri in literatura

1. CJUH-JLU-China: Heartecho: A cancer screening kit for post-myocardial infarction... (2024) - Project Promotion [English] - iGEM Video Universe [Internet]. [cit 12. máj 2025]. Available at: https://video.igem.org/videos/embed/add193b9-cecd-4f9a-9eea-e6ef14ec437c

2. Li N, Huang Z, Zhang Y, Sun H, Wang J, Zhao J. Increased cancer risk after myocardial infarction: fact or fiction? A systemic review and meta-analysis. Cancer Manag Res. 01. marec 2019;11:1959–68.