Genetsko kodiranje in izražanje RNA origami citoskeleta v sintetičnih celicah

Izhodiščni članek: Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells

Uvod

Temeljni cilj sintezne biologije je zgraditi nekaj novega. Pri tem se uporabljata dva pristopa; od zgoraj navzdol in od spodaj navzgor. Cilj pristopa od spodaj navzgor je, iz neživih molekularnih komponent ustvari celico, ki je minimalna enota življenja. Osrednji del teh prizadevanj je reševanje specifičnih inženirskih težav, kot so kompartmentalizacija, oskrba z energijo, metabolizem, replikacija in biosinteza, da bi bile sintetične celice sposobne zgraditi svoje lastne komponente z uporabo intrinzičnega genoma in okoljskih hranil. S tem bi lahko izpolnile zahteve osrednje dogme molekularne biologije, ki pravi, da informacije tečejo od DNA (informacija) do RNA (ojačenje in regulacija) in končno do proteinov (funkcija). Vendar pa osrednja dogma zahteva razvoj relativno zapletenega sistema [1, 2].

Za izdelavo sintetičnih celic se najpogosteje uporabljajo veliki unilamelarni vezikli (ang. Giant unilamellar vesicles, GUV), ki dobro posnemajo celične membrane, so združljivi z membranskimi proteini in omogočajo natančno sintezo z visoko ponovljivostjo. Vendar izražanje proteinov znotraj GUV predstavlja velik izziv zaradi omejenega števila prisotnih proteinov znotraj veziklov in njihovih medsebojnih interakcij, omejenih postranslacijskih modifikacij ter omejene življenjske dobe proteinov. Sintetična celica, ki deluje v skladu s centralno dogmo, zahtevala več kot 150 genov samo za transkripcijsko-translacijski mehanizem. Ena od možnih rešitev je sistema z le enim korakom med genotipom in fenotipom. Nanotehnologija DNA je olajšala ustvarjanje strukturnih in funkcionalnih analogov celičnih proteinov na osnovi nukleinskih kislin, kar predstavlja začetne korake k razvoju sintetičnih celic brez proteinov. Z uporabo nanotehnologije DNA so znanstveniki ustvarili DNA citoskelet, vendar ga sintetične celice zaradi potrebnih temperaturnih sprememb ne morejo same sintetizirati. Poleg tega obstajajo druge omejitve, kot so uporaba DNA kot genetskega in funkcionalnega materiala hkrati in zahteve po kemično funkcionalizirani DNA (na primer s holesterolom za sidranje na membrano), kar dodatno otežuje kodiranje in proizvodnjo teh struktur znotraj veziklov. Možna je sicer enkapsulacija sintetiziranih struktur, kar pa ne izpolnjuje zahteve po avtonomnosti. Rešitev teh težav je citoskelet na osnovi RNA origamija, ki se lahko izraža izotermno neposredno znotraj GUV, ki vsebujejo matrično DNA in RNA-polimerazo. RNA strukture so genetsko kodirane, kar pomeni, da lahko sintetične celice same proizvajajo lastne gradnike v aktivnem, neravnovesnem procesu. S tem pridobimo ločena dva tipa nukleinskih kislin; dvoverižna DNA kot informacijska komponenta in enoverižno RNA kot funkcionalna komponenta [1].

Zasnovali so takšne RNA origami ploščice, ki se same povežejo v mikrometrske, tridimenzionalne RNA origami nanocevke. Mehanizem zlaganja RNA origamija spominja na mehanizem prokariontske ekspresije proteinov; ena sama polimerna veriga, ki jo prepisuje RNA polimeraza, se kotranskripcijsko zloži v lokalne terciarne strukture preko notranjih zank, sledi tvorba kvartarnih struktur med posameznimi molekulami preko robnih zank in nadaljnjo povezovanje v daljše strukture nanocevk. Sorodno kot na proteine je z mutacijami DNA mogoče vplivati na strukturo in delovanje nanocevk [1].

Eksperiment

Načrtovanje RNA origamija

Osnovna zaporedja za RNA origami so prevzeli od Geary C. in sod., 2021, in jih modificirali z uporabo programske opreme RNA Origami Automated Design (ROAD), ki je namenjena 3D-modeliranju RNA struktur, analizi poti zlaganja ter načrtovanju zaporedij in povezovalnih zank, kar omogoča povezovanje v stabilne terciarne strukture. ROAD omogoča hitro izdelavo prototipov več različnih ogrodij in raziskovanje učinkov različnih parametrov načrtovanja s kratkim ciklom načrtovanja ter identificira potencialne ovire za zlaganje in oblikuje optimizirana zaporedja [1, 3].

Izražanje RNA origamija v raztopini

S poskusi izražanja RNA so začeli v raztopni. Da so ugotovili, kako je učinkovitost transkripcije odvisna od koncentracije Mg ionov, so poskus izvedli z različnimi koncentracijami Mg(OAc)2. S poskusi so začeli z dvodimenzionalnim RNA origamijem, ki ima dobro definirano strukturo; posamezna RNA molekula se zloži v tri vijačnice, ki se nato sestavijo v petkotnik. Na 3' konec so dodali iSpinach aptamer (iSpi), ki je odgovoren za aktivacijo barvila DFHBI-1T ob vezavi, kar je omogočilo kvantifikacijo uspešnosti procesa sestavljanja. Poskusi so pokazali, da v 1 mM raztopina Mg2+ ionov niso nastale predvidene strukture, medtem ko so jih v 6 mM raztopini Mg2+ ionov dobili [1].

Izražanje RNA origamija znotraj GUV

Poleg enkapsulacije metrične DNA in RNA-polimeraze znotraj GUV je bilo potrebno zagotoviti, da se transkripcija začne šele znotraj GUV, zato je potreben sprožilec procesa. Zaradi omejenega reakcijskega volumna GUV bi izčrpavanje hranil in kopičenje odpadkov ustavilo transkripcijo, zato so uvedli dva različna kontrolna sistema: omejitev esencialnega kofaktorja Mg2+ in omejitev ribonukleotidov (rNTP). Izbrali so magnezijev ionofor, ki omogoča zaprt membranski sitem brez proteinov in je sposoben prenašati Mg2+ čez membrano z visoko specifičnostjo. Težava so odpadki transkripcijskega procesa, ki ne morejo zapustiti vezikla. Za kombiniran uvoz Mg2+, rNTP-jev in odstranjevanje odpadkov so v membrano vključili bakterijsko transmembransko poro α-hemolizin. S premerom 1,4 nm ta pora omogoča nemoten prehod omenjenih snovi, hkrati pa preprečuje uhajanje večjih struktur, kot so matrična DNA, RNA-polimeraze in RNA origami. V tem primeru so transkripcijo kontrolirali z rNTP-ji, ki so jih dodali v raztopino, ko so želeli, da se transkripcija začne [1].

Nastajanje RNA origamija so spremljali z merjenjem fluorescence iSpi znotraj posameznih GUV s konfokalno mikroskopijo. Intenziteta fluorescence znotraj GUV se je kot pričakovano povečevala v primerjavi z raztopino, kar potrjuje uspešno nastajanje RNA origamija tako znotraj veziklov z magnezijevimi ionoforji kot z α-hemolizinom. Kljub uspešnosti obeh sistemov, se je kontrolni sistem z α-hemolizinom izkazal za uspešnejšega, ker omogoča prehajanje vseh potrebnih ionov in so jih lahko dodali po tem, ko so vezikli že nastali. Ker je tvorba veziklov občutljiva na ione, so s tem dosegli večjo učinkovitost njihove tvorbe [1].

Ko-transkripcijsko zlaganje RNA origami nanocevk

Nato so želeli iz majhnega števila genov ustvariti mikrotubulom podobne strukture velikosti celice, ki se zlagajo kotranskripcijsko. Zasnovali so RNA nanocevke divjega tipa (WT). Nastajanje ploščic WT, skladnih z in silico zasnovanimi, so eksperimentalno potrdili z mikroskopijo na atomsko silo (AFM). Ko-transkripcijsko zložene ploščice so se sestavile v votle nanocevke dolžine do nekaj mikrometrov, ki zaradi močnih interakcij končnih zank RNA nanocevk prenesejo temperature do 50 °C . Nato so zasnovali še ploščice z iSpi, ki so jih dodali na 3' konce monomernih enot, da so lahko nanocevke opazovali s konfokalno mikroskopijo. Potrdili so, da so dobili mreže, podobne citoskeletu, s premerom več deset mikrometrov [1].

Ker je modifikacija posameznih ploščic ključna za ustvarjanje funkcionalnih citoskeletov, so preverili še vpliv dodatka dvoverižne zanke na 3' koncu (dsOV). Izkazalo se je, da dodatek relativno obsežnih zaporedij iSpi in dsOV ne vpliva na dolžino samih ploščic oziroma nanocevk, ampak poveča njihovo fleksibilnost, kar povzroči hitrejši prelom nanocevk [1].

Fenotipska plastičnost sistema

Pri pregledu struktur so v redkih primerih opazili nastanek obročev namesto nanocevk. To so povezali z mutacijami, kar dokazuje fenotipsko plastičnost sistema. S skoraj istim zaporedjem RNA so dobili dva izrazito različna fenotipa, kar nakazuje na številne možnosti za usmerjeno evolucijo [1].

Izražanje RNA origami citoskeletov v sintetičnih celicah

Citoskelet igra ključno vlogo pri uravnavanju oblike in trdnosti celic. Potem ko so zgradili citoskeletu podobne RNA nanocevke, ki se ko-transkripcijsko zlagajo, je bil naslednji korak njihovo izražanje znotraj GUV. Transkripcijo ploščic iSpi znotraj GUV so sprožili z dodajanjem rNTP-jev preko por α-hemolizina. Proces so spremljali s konfokalno mikroskopijo, ki je po šestih urah pokazala pojav mreže RNA origami nanocevk [1].

Na koncu so želeli doseči, da bi se citoskelet vezal na membrano, zato so dodali še biotinski aptamer. Te ploščice so izrazili v GUV s 5 % biotiniliranih lipidov. RNA nanocevke, ki so vsebovale iSpi in biotinske aptamere, so se kot predvideno povezale v mrežo na notranji strani membrane GUV, medtem ko so se nanocevke brez biotinskega aptamera koncentrirale v središču GUV [1].

Zaključek

Sintetične celice imajo pomembno vlogo pri razumevanju delovanja živih sistemov. Imajo pa tudi aplikacije v vsakdanjem življenju. V primerjavi z bioinženirskimi celičnimi sistemi jih je mnogo lažje prilagajati in spreminjati na molekularni ravni, zato imajo potencial uporabe kot odzivna zdravila, ki sproščajo spojine, ko prejmejo signal iz bioloških sistemov. Biomedicinske aplikacije vključujejo zdravljenje raka in nadomestne terapije z encimi. Številni izzivi dela z živimi sistemi, zanje ne veljajo. Pomembna je predvsem njihova robustnost, saj so sposobne prenašati nenaravne in za celico toksične pogoje [4].

Sinteza RNA origami citoskeleta znotraj veziklov predstavlja velik korak k strukturiranju sintetičnih celic. Z nadaljnjimi študijami bi lahko z vključitvijo ribocimov dosegli tudi sintezo molekularnih strojev, ki izvajajo kompleksne celične naloge, znotraj veziklov. Polimerazni ribocimi, bi lahko v tem sistemu nadomestili potrebo po vključitvi proteinske RNA polimeraze v celice. Genetsko kodirana strojna oprema, izdelana iz RNA origamija, bi lahko vodila do novih biofizikalnih orodij za manipulacijo celic in reševanje vprašanj v celični biologiji [1].

Literatura

[1] M. P. Tran, T. Chakraborty, E. Poppleton, L. Monari, M. Illig, F. Giessler, K. Göpfrich: Genetic encoding and expression of RNA origami cytoskeletons in synthetic cells. Nat. Nanotechnol. 2025, 20, 664–671.

[2] C. Guindani, L. C. Da Silva, S. Cao, T. Ivanov, K. Landfester: Synthetic Cells: From Simple Bio‐Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed 2022, 61, e202110855.

[3] C. Geary, G. Grossi, E. K. S. McRae, P. W. K. Rothemund, E. S. Andersen: RNA origami design tools enable cotranscriptional folding of kilobase-sized nanoscaffolds. Nat. Chem. 2021, 13, 549–558.

[4] K. P. Adamala, M. Dogterom, Y. Elani, P. Schwille, M. Takinoue, T.-Y. D. Tang: Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol 2024, 25, 162–167.