NomNomNylon

Projekt: Projekt skupine DTU Denmark

Uvod

Najlon je naziv za skupino sinteznih polimerov, ki spadajo v skupino poliamidov. Je termoplastičen material, ki ga gradijo monomeri povezani s peptidno vezjo. Široko se uporablja v tekstilni industriji, najbolj znamenit primer so ženske najlonske nogavice. Danes se na široko uporablja za proizvodnjo športnih oblačil, kopalk, puhovk in vetrovk. Vsako leto nastane 92 milijonov ton tekstilnega odpada, napoved za leto 2030 pa je kar 134 milijonov to. Vsako leto namreč nastane 100 milijard novih kosov oblačil. To predstavlja veliko ekološko in tudi ekonomsko breme, saj na letni ravni povzroča izgube v vrednosti 500 milijard ameriških dolarjev. Najlon je eden izmed najzahtevnejših za razgradnjo in reciklažo. Uspešno se ga reciklira samo 2%. V primerjavi z bombažem, ki je biorazgradljiv in poliestreom, ki ga lahko mehansko recikliramo najlon ostaja desetletja in se fragmentira v mikroplastiko. Mehansko recikliranje pri najlonu ni uporabno zaradi njegove kompleksne kemične strukture, naprednejši proces kemičnega recikliranja pa je še v zgodnjih fazah razvoja in še ni široko uporabljena metoda. Reševanja problema se je lotila študentska ekipa DTU Denmark na tekmovanju iGEM leta 2025.

O projektu

Ekipa je projekt naredila na podlagi DBTL koncepta, kar pomeni Design Build Test Learn oz. v prevodu Načrtuj Zgradi Testiraj Nauči se. Ta združuje računalniško načrtovanje in eksperimentalno delo v laboratoriju. Zasnova projekta je naslednja. Vse se začne s kupom odpadnega najlona, ki predstavlja vir ogljika. Da bi te odpadke predelali, moramo najlon najprej razgraditi na njegove osnovne gradnike. To dosežemo z brezcelično encimsko predobdelavo. Pri tem uporabljamo izboljšano različico encima najlonaze NylC, ki smo ga optimizirali s pomočjo računalniškega načrtovanja proteinov. NylC ima namreč v osnovi nizko aktivnost in ni termostabilen, kar omejuje učinkovitost razgradnje najlona. Tako pripravljene oligomere in monomere nato prevzamejo gensko spremenjene bakterije Pseudomonas putida. Ta vrsta bakterij ima zelo raznolik metabolizem, kar je idealno za uporabo v sintetični biologiji. Spremenjena je tako, da lahko poleg monomerov razgradi tudi oligomere, kar ji omogoča sintetičen nylABC operon inkorporiran v njen genom. Končni produkt z visoko dodano vrednostjo je indigoidin. Gre za biološko pridobljeno nestrupeno barvilo, ki bi nadomestilo sicer petrokemijsko pridobljen indigo. Oba se uporabljata v postopku barvanja kavbojk.

Računalniško načrtovanje

Najlonaze so encimi sposobni razgradnje najlona. NylC začne depolimerizacijo nylon-6, ki je poglaviten v tekstilni industriji. NylC cepi 6-aminoheksanoate(Ahx) polimere v oligomere. Deluje poljubno v sredini, kar je ključnega pomena. NylC je N-terminalna nukleofilna (Ntn) hidrolaza. Po procesu samocepitve preide iz nekativno v aktivno obliko encima. Druga hidrolaza je še NylB, ki je aktivna na koncih verig in cepi linearne oligomere v krajše verig. Sledi še NylA, ki specifično prepoznava ciklične dimere in pretvarja cikličen Ahx2 v linearno obliko. NylA, NylB in NylC skupaj tvorijo kooperativen mehanizem, ki nas pripelje do željenega končnega monomera Ahx - 6 - amoninoheksanoat. Bakterijski sevi s kateri so delali v nadaljevanju so vsebovali vse tri najlonaze, saj so bili podvrženi procesu ALE - adaptivna laboratorijska evolucija, in so sposobni rasti na različnih monomerih najlona vključno z Ahx.

Omejuje nas dejstvo, da je za proces razgradnje najlona potreben korak predobdelave. Uporablja se NylC, ki pa ima nizko učinkovitost in ni termostabilen. NylC ne zadostuje za tovrstno predobdelavo, saj je pretvorba izvedljiva le nad temperaturo steklastega prehoda najlona, ki je pri približno 55 °C, medtem ko ima encim NylC temperaturo taljenja Tm pri 52 °C. Da bi premagali to oviro, je ekipa zasnovala in razvila postopek za inženirstvo proteinov. Ta uporablja najsodobnejša orodja, temelječa na strojnem učenju, kot sta ThermoMPNN in ESM, ter njihov lastni proteinski jezikovni model Axolotl. Axolotl je difuzijski proteinski jezikovni model zmožen generiranja proteinskih sekvenc de novo. ThermoCraft je visoko zmogljiv in od vrste proteina neodvisen postopek za načrtovanje mutacij za izboljšano termostabilnost in aktivnost. Postopek deluje v načinu za posamezne točkovne mutacije, z uporabo orodja ThermoMPNN in v načinu za hkratno uvajanje številnih sprememb z uporabo modela Axolotl in Pottsovega modela.

Raziskali so tudi encimsko biodiverziteto s pomočjo rudarjenja sekvenc (sequence mining). Temeljilo je na odkritju TvgC, termofilne različice encima NylC. Ta je izjemno termostabilna, Tm= 93°C in je aktivna na najlon-6 in najlon-66 različicah. Ostane termostabilna tudi po enem tednu izpostavljenosti na 60°C. Sistematično so iskali neraziskane termostabilne najlonaze v termostabilnih organizmih s temperaturnim optimumom ≥ 50°C. Naredili so podatkovno bazo proteinov iz termofilov na podlagi podatkovnih baz ThermoBase in UniProt. Pridobljene proteinske sekvence so bile analizirane s pomočjo Foldseek in JackHMMER. Foldseek temelji na strukturnih homologijah, medtem ko JackHMMER na sekvenčnih homologijah. Te analize so obrodile več potencialnih homologov, ki so jih omejili s filtriranjem glede na prisotnost in poravnavo katalitičnih ostankov encima NylC - Lys189, Asn219, Thr267, Asp306 and Asp308. Še višjo raven filtriranja so dosegli z uporabo mrež podobnosti zaporedij (SSN) pri pragu poravnave 100, kar je omogočilo identifikacijo skupine homologov, ki so tesno povezani s TvgC. Na žalost teh homologov zaradi pomanjkanja časa niso uspeli eksperimentalno potrditi in karakterizirati.

Eksperimentalno delo

Karakterizirali so P.putida seve pridobljene iz Institute of BioGeosciences v Julichu. Analizirali so rast sevov KT2440, NYL, NYLON-A, NYLON-B, NYLON-C in NYLON-ABC na različnih virih ogljika. Rast je potekala v mediju MSM. Gre za medij mineralne soli z dodatkom monomerov, dimerov in trimerov najlona. Opazovalni so bili specifični efekti encimov NylA, NylB in NylC. NYLON-C in NYLON-B sta imela najširši spekter rasti na različnih substratih. Opazovana je bila tudi rast seva NYL, ki lahko preživi izključno na monomerih najlona kot edinemu viru C. Paraleno je potekalo testiranje različnih najlonaz in vitro. Uporabili so 6 različnih plazmidov iz Addgene, vsak je kodiral eno NylC. Različice so bile NylCA in termostabilna verzija NylCA-TS, NylCK in termostabilna verzija NylCK-TS in NylSp2 in termostabilna verzija NylSp2-TS. Eden od kupljenih variantnih plazmidov NylCp2_pET28a, je služil kot začetna predloga za uvajanje mutacij, ki jih je v prejšnjem koraku določil računalniški postopek. Za uvedbo teh mutacij so načrtovali specifične začetne oligonukleotide za usmerjeno točkovno mutagenezo. Po izvedbi mutageneze so plazmide najprej vstavili v bakterijo E. coli DH5α za namnoževanje in preverjanje zaporedja. S Sangerjevim sekvenciranjem so potrdili pravilnost mutacij in plazmide vstavili v E. coli BL21 za izražanje proteinov. Po izražanju so izvedli drug krog čiščenja, ki je vključeval tako naše načrtovane mutante kot tudi različice iz zbirke Addgene, pri čemer so vse vzorce obdelali vzporedno po enakem postopku. Vzorci so bili nato analizirani.

Uvedli so preprosto in učinkovito metodo, ki združuje tankoplastno kromatografijo in barvanje z ninhidrinom za analizo razgradnje najlona. Ta metoda na TLC-plošči loči produkte razgradnje najlona, ki jih nato vizualiziramo z ninhidrinom, ki reagira z aminskimi skupinami. Reakcija z ninhidrinom ob stiku s prostimi amino skupinami povzroči nastanek vijoličnega obarvanja. To je še posebej uporabno za zaznavanje produktov encimske hidrolize cikličnih oligomerov Ahx, ki jo izvaja NylC. Linearni oligomeri Ahx, ki se sprostijo pri endo-delujoči hidrolizi encima NylC, namreč vsebujejo proste amino skupine, ki jih vizualiziramo z omenjeno vijolično barvo. Za identifikacijo produktov razgradnje najlona so uporabili masno spektrometrijo MALDI-TOF. Ta analiza je potrdila, da so naši načrtovani encimi razgradili najlon do monomerov in dimerov, kar je skladno z rezultati TLC. Rezultati analiz so potrdili, da lahko encimi učinkovito razgradijo najlon do monomerov in dimerov pri temperaturah do 55 °C. Izmerili so tudi toplotno stabilnost očiščenih encimov. Najvišji Tm sta imeli varianti NylCK 67.5°C in NylCp2 D122N 64.1°C.

Za prikaz uporabnosti načrtovanega seva kot šasije so v bakterijo P. putida NYLON-ABC najprej vstavili plazmid za proizvodnjo β-karotena. To je služilo kot dokaz koncepta za izražanje heterologne biosintezne poti. Po potrditvi delovanja so enak delovni postopek uporabili za uvedbo biosintezne poti za indigoidin. Zaporedja DNK genov biosintezne poti za indigoidin, bpsA in pcpS (PPTaza), so prejeli prek registra iGEM (biokocki BBa_K4605002 in BBa_K4605011). Zaporedji so kodonsko prilagodili z uporabo frekvenc rabe kodonov za bakterijo P. putida ter jih dodali v register kot nova gradnika (biokocki BBa_25PI7P3J in BBa_2529WIHD). Kodonsko prilagojena gena bpsA in pcpS so uporabili za sestavljanje ekspresijskega plazmida pPS1-indigoidine. Ekspresijski plazmid pPS1-indigoidine je bil sestavljen s pomočjo Gibsonovega sestavljanja. Gen pcpS in ogrodje plazmida pPS1 so pomnožili z metodo PCR.

Nastali produkt je bil transformiran v E. coli DH5α kompetentne celice. Zrasle kolonije so bile pregledane z metodo PCR in poslane na nadaljnje sekvenciranje. Proizvodnjo indigoidina je bila okarakterizirana tako na tradicionalnih virih ogljika kot tudi na gojiščih najlona kot edinim virom ogljika. Poleg tega je bila preučena sposobnost barvila za barvanje bombažnih in sintetičnih vlaken, ki se je izkazala za uspešno.

Zaključek

V bakteriji Pseudomonas putida smo dosegli proizvodnjo pigmenta indigoidina z vstavljanjem kodonsko prilagojenih genov bpsA in pcpS (PPTaza). Načrtovani sev je modri pigment proizvajal tako na glukozi kot tudi med rastjo na gradnikih, pridobljenih iz najlona. To dokazuje, da lahko Pseudomonas uporablja odpadni najlon kot vir ogljika za biosintezo.

S tem smo zagotovili novo celično ogrodje in dokaz koncepta poti za pretvorbo plastičnih odpadkov v uporabne ali dragocene izdelke, kar predstavlja temelj za prihodnje ekipe na področju trajnostne proizvodnje. Poleg tega bo ta optimizacija koristila prihodnjim iGEM ekipam, ki bodo z uporabo bakterije Pseudomonas putida razvijale različne izdelke z visoko dodano vrednostjo. Projekt je prispeval 24 osnovnih in 2 kompozitna kosa v iGEM Registry of Standard Biological Parts.

Viri

1.) https://2025.igem.wiki/dtu-denmark/ 2.) https://sl.wikipedia.org/wiki/Najlon 3.) https://businesswaste.com/waste-types/textile-waste/textile-waste-facts/