SKIPPIT

SKIPPIT je projekt študentske skupine iz Barcelone, ki je na tekmovanju iGEM leta 2025 osvojila zlato medaljo.

Uvod

Sintezni biologi so se zadnjih 50 let na področju regulacije izražanja proteinov fokusirali predvsem na kontrolo transkripcije z manipulacijo DNA. Pogoste metode temeljijo na uporabi transkripcijskih faktorjev in kemijsko inducibilnih promotorjev ter na regulaciji izražanja genov z RNA interferenco ali CRISPR. Te metode so sicer efektivne, a je odziv navadno počasen, saj vsebuje dodatno stopnjo sinteze in procesiranja RNA, problem interferenčnih metod pa je lahko tudi izven tarčno delovanje. Razvoj sintezne biologije bi se v prihodnosti tako moral osredotočiti na razvoj učinkovitejših in hitrejših orodij, ki bi jih bilo mogoče programirati.

Opis projekta

Študentska skupina se je vprašala, ali bi bilo mogoče ustvariti element, ki bi izražanje proteina reguliral na ravni transkripcije. Njihova ideja temelji na uporabi elementov SCR (stop codon readthrough elements). Gre za sekvence mRNA, ki se organizirajo v strukture, ki so sposobne interagirati z ribosomom na mestu stop kodona. Ta interakcija onemogoči terminacijo translacije in protein se tako sintetizira preko stop kodona. Na osnovi elementa SCR so želeli ustvariti RNA stikalo, ki bi se odzvalo na določen signal s spremembo strukture elementa SCR in posledično induciralo ali onemogočilo preskok stop kodona. Osnovna zgradba takega stikala vključuje: • Funkcionalni element RNA (FRE – functional RNA element) – sekvenca RNA, katere delovanje je odvisno od njene sekundarne strukture (v tem primeru element SCR). Preizkusili so dva elementa – SCR-D in SECIS DIO2. • Konformacijski element RNA (CRE – conformational RNA element) – sekvenca RNA, katere konformacija se spremeni po interakciji s specifičnim ligandom (aptamer). V tem stikalu so uporabili aptamer za teofilin (Theo-ON-5 aptamer). • Veznik (linker) – kratek oligomer, ki povezuje funkcionalna dela in omogoča, da nahajata v ustreznih konformacijah glede na prisotnost ali odsotnost liganda. Veznike so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE. Končno stikalo so zasnovali tako, da bi bil v odsotnosti liganda SCR del interagiral z ribosomom na mestu stop kodona in induciral prestop stop kodona ter omogočal izražanje dveh proteinov. V prisotnosti liganda bi aptamerni del stikala spremenil konformacijo, kar bi vplivalo tudi na konformacijo SCR dela. Ta ne bi bil več zmožen interagirati z ribosomom na mestu stop kodona in translacija bi se ustavila po transkripciji prvega proteina, drugi pa se ne bi izrazil.