SKIPPIT

SKIPPIT je projekt študentske skupine iz Barcelone, ki je na tekmovanju iGEM leta 2025 osvojila zlato medaljo.

Uvod

Sintezni biologi so se zadnjih 50 let na področju regulacije izražanja proteinov fokusirali predvsem na kontrolo transkripcije z manipulacijo DNA. Pogoste metode temeljijo na uporabi transkripcijskih faktorjev in kemijsko inducibilnih promotorjev ter na regulaciji izražanja genov z RNA interferenco ali CRISPR. Te metode so sicer efektivne, a je odziv navadno počasen, saj vsebuje dodatno stopnjo sinteze in procesiranja RNA, problem interferenčnih metod pa je lahko tudi izven tarčno delovanje. Razvoj sintezne biologije bi se v prihodnosti tako moral osredotočiti na razvoj učinkovitejših in hitrejših orodij, ki bi jih bilo mogoče programirati.

Opis projekta

Študentska skupina se je vprašala, ali bi bilo mogoče ustvariti element, ki bi izražanje proteina reguliral na ravni translacije. Njihova ideja temelji na uporabi elementov SCR (stop codon readthrough elements). Gre za sekvence mRNA, ki se organizirajo v strukture, ki so sposobne interagirati z ribosomom na mestu stop kodona. Ta interakcija onemogoči terminacijo translacije in protein se tako sintetizira preko stop kodona. Na osnovi elementa SCR so želeli ustvariti RNA stikalo, ki bi se odzvalo na določen signal s spremembo strukture elementa SCR in posledično induciralo ali onemogočilo preskok stop kodona.

Osnovna zgradba takega stikala vključuje:

• Funkcionalni element RNA (FRE – functional RNA element) – sekvenca RNA, katere delovanje je odvisno od njene sekundarne strukture (v tem primeru element SCR). Preizkusili so dva elementa – SCR-D in SECIS DIO2.

• Konformacijski element RNA (CRE – conformational RNA element) – sekvenca RNA, katere konformacija se spremeni po interakciji s specifičnim ligandom (aptamer). V tem stikalu so uporabili aptamer za teofilin (Theo-ON-5 aptamer).

• Veznik (linker) – kratek oligomer, ki povezuje funkcionalna dela in omogoča, da nahajata v ustreznih konformacijah glede na prisotnost ali odsotnost liganda. Veznike so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

Končno stikalo so zasnovali tako, da bi bil v odsotnosti liganda SCR del interagiral z ribosomom na mestu stop kodona in induciral prestop stop kodona ter omogočal izražanje dveh proteinov. V prisotnosti liganda bi aptamerni del stikala spremenil konformacijo, kar bi vplivalo tudi na konformacijo SCR dela. Ta ne bi bil več zmožen interagirati z ribosomom na mestu stop kodona in translacija bi se ustavila po transkripciji prvega proteina, drugi pa se ne bi izrazil.

Eksperimentalni del

Pred sestavo stikala je skupina vsak element posebej testirala v celicah HEK293T in v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov. Uporabili so test, ki je temeljil na izražanju dveh različnih luciferaz – luciferaze iz ožigalkarja Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke. Incidenco preskoka stop kodona in posledično aktivnost posameznega elementa, so kvantificirali z razmerjem luminiscence luciferaze iz Renilla reniformis in luciferaze iz kresničke.

SCR-D

Kot prvi element SCR so preizkusili SCR-D. Konstrukt vsebuje zapis za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis, ki se konča s stop kodonom TGA. Temu sledi regija SCR-D, ki je od ostalih delov konstrukta ločena z dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A. Nazadnje sledi še zapis za luciferazo iz kresničke. Pričakovano je, da bo tak konstrukt omogočal izražanje obeh luciferaz, saj bi morala prisotnost celotnega, funkcionalnega zaporedja SCR-D omogočati preskok stop kodona. To se je tudi zgodilo – s tem konstruktom so dosegli 9-% preskok stop kodona v celicah HEK293T, kar je za sesalske celice veliko.

Žal se je izkazalo, da aktivnost SCR-D ni odvisna od sekundarne strukture celotnega konstrukta – v primerih, ko so odstranili vse razen najbolj ohranjenega dela (PreDiapin) ali pa so odstranili le manj ohranjen del konstrukta (Hypopin) se je izkazalo, da aktivnost ne pade na 0 %, kot bi pričakovali. V primeru, ko so mutirali močno ohranjen del (PreDiapin) je aktivnost padla le za 1 %, kar kaže na to, da specifično nukleotidno zaporedje tega dela ni ključno za aktivnost elementa. Na podlagi teh rezultatov so sklenili, da SCR-D ni primeren element za konstrukcijo RNA stikala, saj naj bi to delovalo na osnovi specifičnih strukturnih sprememb.

SECIS

V nadaljevanju so v celicah HEK293T karakterizirali SCR element SECIS (Selenocysteine Insertion Sequence). Gre za dobro okarakteriziran strukturni motiv s ponovljivo aktivnostjo preskoka stop kodona.

Konstrukt je ponovno vseboval zapisa za luciferazo iz ožigalkarja Renilla reniformis in za luciferazo iz kresničke. Men genoma se je nahajal stop kodon med dvema samoizrezovalnima zaporedjema T2A, Zadnji del konstrukta pa je zaporedje SECIS. Tak konstrukt bi moral ponovno omogočiti izražanje obeh luciferaz, saj naj bi prisotnost aktivnega SECIS interagirala s stop kodonom.

Literatura navaja, da dodajanje selena ojača aktivnost SECIS elementa v sesalskih celicah. Da bi to preverili, so testirali aktivnost pri različnih koncentracijah teofilina in selena v treh neodvisnih eksperimentalnih krogih.

Izkazalo se je, da je SECIS element stabilen in zanesljiv v celicah HEK293T in da je uspešnost preskoka stop kodona konsistentno 8 – 10-% pri vseh eksperimentalnih pogojih. Aktivnost SECIS največja ob 100 nM dodatku selena, čeprav ta sam po sebi ni potreben za samo aktivnost elementa, ampak jo samo ojača. Po drugi strani pa teofilin do 1 mM koncentracije rahlo zmanjša aktivnost SECIS, pri 5 mM koncentraciji pa jo močno zmanjša. Iz tega so sklenili, da mora biti delovna koncentracija teofilina med 0 in 1 mM.

Isti element so nato testirali še v brezceličnem ekspresijskem sistemu. V tem sistemu dodajanje selena ni bilo potrebno, saj ja komercialni lizat vseboval vse potrebne kofaktorje. V tem primeru je bil za delovanje potreben protein SBP2 (SECIS-binding protein 2). Ta prepozna lasnično zanko elementa SECIS in aktivira mehanizem za vstavljanje selenocisteina. Za zagotovitev prisotnosti tega proteina so uporabili plazmid na katerem je bil zapis za SBP2 pod promotorjem T7. Eksperimenti so pokazali, da je aktivnost SECIS v brezceličnem sistemu odvisna od koncentracije SBP2. V primeru, ko v sistem niso dodali SBP2, je bila aktivnost preskoka stop kodona 0-%, pri povišanju koncentracije SBP2 na 300 ng/μL, pa je narasla na 14 %, kar je celo višje od aktivnosti, ki so jo zaznali v celicah HEK293T.

Aptamer

V nadaljevanju so testirali teofilinski aptamer Theo-ON-5, ki so ga izbrali zaradi visoke specifičnosti, poleg tega pa ga v sesalski celicah ni. Zaradi dobro okarakterizirane sekundarne strukture je bil perfekten kandidat za uporabo v stikalu. Pred uporabo v stikalu so želeli preveriti odzivnost na teofilin in določiti optimalne eksperimentalne pogoje za uporabo v celicah HEK293T.

Konstrukt, ki so ga uporabili za testiranje, je vseboval zapis za luciferazo iz Renilla reniformis , ki mu je sledil tako imenovan psevdovozel, ki omogoča premik bralnega okvirja (frameshift pseudoknot). Del konstrukta sta bila tudi teofilinski aptamer in zapis za luciferazo iz kresničke. Ta dva elementa se v tem konstruktu nista nahajala v bralnem okvirju, ki bi omogočal njuno ekspresijo. V odsotnosti teofilina se psevdovozel ne zvije v pravilno strukturo, kar onemogoči premik bralnega okvirja, zato ne pride do izražanja luciferaze izn kresničke. Ko je teofilin prisoten se ta veže na aptamer, kar spremeni strukturo celotnega konstrukta in dovoli psevdovozlu, da zavzame ustrezno strukturo, ta pa lahko inducira premik bralnega okvirja, kar postavi gen za luciferazo iz kresničke v ustrezen bralni okvir in omogoča njegovo izražanje.

Žal se je izkazalo, da se aptamer v celicah HEK293T na teofilin ne odziva konsistentno. Čeprav so nekateri podatki nakazovali na pričakovan trend, so bile razlike minimalne in ne tako velike, kot tiste, ki so bile podane v literaturi. Ekipa je predvidevala, da bi se to lahko zgodilo zaradi temperaturne nestabilnosti aptamera – ta je bil originalno namreč okarakteriziran pri 30 °C. Uporaba pri 37 °C bi lahko tako povzročila delno denaturacijo njegove strukture, kar bi oviralo ustrezno zvitje in vezavo liganda.

Konstrukt so nadaljnje testirali še v brezceličnem sistemu. Ta funkcionira pri 30 °C, kar se je izkazalo za ustreznejšo temperaturo za delovanje aptamera. V tem primeru se je incidenca premika bralnega okvirja povečala iz 7 % pri 0 mM koncentraciji teofilina na 15 % pri 2,4 mM koncentraciji teofilina. Ti rezultati potrjujejo, da je teofilinski apamer popolnoma funkcionalen v brezceličnih ekspresijskih sistemi pri 30 °C.

RNA stikala

Po validaciji obeh elementov RNA stikala v brezceličnem sistemu in optimizaciji koncentracije SBP2 (300 ng/mL) in teofilina (0 – 2,4 mM) je bil čas za sestavo stikal. Sestavili so 4 konstrukte, ki so se med seboj razlikovali le po dolžini veznika (L5 – veznik dolg 5 nukleotidov, L7 – veznik dolg 7 nukleotidov, L8 – veznik dolg 8 nukleotidov in L9 – veznik dolg 9 nukleotidov). Te so načrtovali z računalniškim orodjem TADPOLE.

V primeru kontrole, ki je vsebovala le aktiven SECIS, je bila aktivnost preskoka stop kodona 6-% (manj kot pri prejšnjih testiranjih: 12 – 14 %). To variacijo je skupina pripisala razlikam v aktivnostih posameznih lizatov.

Ko sta bila dodana aptamer in veznik, se je aktivnost SECIS delno zmanjšala – incidenca preskoka stop kodona je padla s 6 % na pod 4 % pri L5, na 3 % pri L7 in L8 in na 2 % pri L9. Ob dodatku teofilina je aktivnost preskoka stop kodona padla na približno 1 % pri vseh variantah, kar demonstrira konsistenten efekt stikala.

Zanimivo je, da je jakost preklopa med stanjema odvisna od dolžine veznika – najkrajši veznik (L5) bolje ohranja začetno strukturo SECIS , kar verjetno pripomore k močnejšemu preklopu. Arhitektura veznika torej direktno vpliva na funkcionalno povezavo med aptamerom in SECIS.

Zaključek

Študentska skupina je z opisanimi eksperimenti dokazala, da sta SECIS DIO2 in aptamer Theo-ON-5 funkcionalna v brezceličnem sistemu zajčjih retikulocitov in da lahko s kombiniranjem le-teh sestavimo regulatorno enoto, ki se odziva na teofilin. Dolžina veznika med enotami stikala določa bazalno aktivnost stikala in jakost preklopa ter predstavlja zanimiv vidik za nadaljnje raziskave in sestavo podobnih konstruktov v prihodnosti.

Viri

Barcelona-UB: Creation of Riboswitches (2025) - iGEM Video Universe. Accessed April 29, 2026. https://video.igem.org/videos/embed/wnAAjLnQPJYmF384yfE5J7?loop=1&autoplay=1