Vpliv optogenetske stimulacije na izražanje nevronskih genov v človeških mezenhimskih matičnih celicah, pridobljenih iz kostnega mozga in maščobnega tkiva

Uvod

Nevrodegenerativne bolezni predstavljajo velik izziv sodobne medicine, saj so povezane s progresivno izgubo nevronov, kar vodi do motenj v kognitivnih funkcijah, vedenju in gibanju. Kljub številnim raziskavam učinkovite terapevtske strategije še vedno niso zadostno razvite, zato se znanstveniki osredotočajo na nove pristope regenerativne medicine. Pomembno vlogo pri tem imajo mezenhimske matične celice (MSC), ki imajo sposobnost samoobnavljanja in diferenciacije v različne celične tipe, vključno z nevroni in glialnimi celicami. Najpogosteje jih pridobivajo iz kostnega mozga (BM-MSC) in maščobnega tkiva (A-MSC). Celice iz maščobnega tkiva omogočajo manj invaziven odvzem in večji izplen celic, zato predstavljajo zanimivo možnost za uporabo v regenerativni medicini. Klasične metode diferenciacije MSC večinoma temeljijo na uporabi rastnih faktorjev in kemijskih induktorjev, vendar imajo številne omejitve. Pogosto so povezane z nizko stabilnostjo, hitro razgradnjo dejavnikov in omejeno učinkovitostjo. Zaradi tega se razvijajo novi pristopi, med katerimi je tudi optogenetika. Optogenetika združuje genetske in optične metode za natančen nadzor celičnih procesov v prostoru in času. Temelji na izražanju svetlobno občutljivih ionskih kanalov, kot je channelrhodopsin-2 (ChR2), ki se aktivira z modro svetlobo. Aktivacija kanala omogoča vtok kationov v celico, kar lahko vpliva na signalne poti, povezane s proliferacijo, diferenciacijo in preživetjem celic.

Namen in hipoteza raziskave

Namen raziskave je bil ovrednotiti vpliv optogenetske stimulacije na izražanje nevronskih markerjev v mezenhimskih matičnih celicah, pridobljenih iz kostnega mozga in maščobnega tkiva. Raziskovalci so predpostavili, da bo ekspresija ChR2 v BM-MSC in A-MSC v kombinaciji z izpostavitvijo modri svetlobi valovne dolžine 470 nm povzročila spremembe v membranskem potencialu ter povečala znotrajcelični tok kationov, predvsem kalcijevih ionov (Ca²⁺). Posledično naj bi se aktivirale signalne poti, povezane z nevronsko diferenciacijo, kar bi povzročilo povečano izražanje nevronskih markerjev, kot so Nestin, β-tubulin III, Doublecortin (DCX) in Rbfox3 oziroma NeuN. Dodatni namen raziskave je bil preveriti, ali optogenetska stimulacija vpliva na celično viabilnost ter ali povzroča morebitne citotoksične učinke.

Eksperimentalni pristop

V raziskavi so uporabili humane BM-MSC in A-MSC, pridobljene iz banke matičnih celic. Celice so gojili v α-MEM gojišču, suplementiranem z 10 % fetalnega govejega seruma, penicilin-streptomicinom in L-glutaminom pri temperaturi 37 °C in 5 % CO₂. Za optogenetsko manipulacijo so uporabili plazmidni vektor pcDNA3.1/hChR2(H134R)-EYFP, ki kodira svetlobno občutljiv ionski kanal ChR2 v fuziji s fluorescenčnim proteinom EYFP. Plazmid so najprej namnožili v bakterijah in izolirali s komercialnim kitom za izolacijo plazmidne DNA. MSC so transfektirali z uporabo reagenta Lipofectamine 3000, kar je omogočilo začasno ekspresijo ChR2 v celicah. Uspešnost transfekcije so preverili s fluorescenčno mikroskopijo na podlagi izražanja EYFP. Po 96 urah so celice izpostavili optični stimulaciji z modro svetlobo valovne dolžine 470 nm pri frekvenci 1 Hz in moči 1 mW. Svetlobna stimulacija je trajala eno uro. Eksperimentalni dizajn je vključeval štiri skupine:

• netransfektirane celice brez svetlobne stimulacije,
• transfektirane celice brez svetlobe,
• netransfektirane celice z osvetlitvijo,
• transfektirane celice z osvetlitvijo.

Po obdelavi so analizirali izražanje nevronskih genov z RT-qPCR, ekspresijo proteina Nestin s pretočno citometrijo, celično viabilnost z MTT testom, apoptozo z Annexin V/PI analizo ter fluorescenco in površino celic z uporabo programa ImageJ.

Morfološka analiza celic

Raziskovalci so s svetlobno mikroskopijo ocenili osnovno morfologijo mezenhimskih matičnih celic ter preverili vpliv optogenetske stimulacije na njihov izgled. Ugotovili so, da imajo tako BM-MSC kot A-MSC značilno fibroblastom podobno, vretenasto obliko. V kontrolnih skupinah in pri celicah, izpostavljenih samo modri svetlobi, niso opazili pomembnih morfoloških sprememb. Nasprotno pa so celice, ki so izražale ChR2, že pred stimulacijo kazale nižjo celično gostoto in bolj podolgovato obliko. Po obsevanju z modro svetlobo se je podolgovatost dodatno povečala, pojavilo pa se je tudi več celičnih izrastkov. Takšne spremembe nakazujejo začetne procese nevronske diferenciacije.

Potrditev ekspresije ChR2

Fluorescenčna mikroskopija je pokazala jasno izražanje fluorescenčnega reporterja EYFP v transfektiranih celicah. Po 96 urah je bila fluorescenca v BM-MSC povečana za 195 AFU, v A-MSC pa za 77 AFU v primerjavi s kontrolnimi skupinami. Rezultati potrjujejo uspešno ekspresijo ChR2 in omogočajo nadaljnjo optogenetsko stimulacijo celic.

Analiza površine celic

Za kvantitativno ovrednotenje sprememb v velikosti celic so uporabili analizo slik v programu ImageJ. Pri BM-MSC kontrolne celice po 48 urah niso pokazale pomembnih sprememb, medtem ko pri ChR2-izražajočih celicah večjih razlik niso zaznali. Pri A-MSC pa so opazili izrazitejši učinek. Celice, ki so izražale ChR2 in bile izpostavljene modri svetlobi, so imele značilno zmanjšano površino v primerjavi z drugimi skupinami. To nakazuje spremembe v celični organizaciji, povezane z diferenciacijo.

Celična viabilnost

Celično viabilnost so ocenili z MTT testom 48 ur po stimulaciji z modro svetlobo. Rezultati so pokazali, da modra svetloba sama rahlo poveča viabilnost in proliferacijo celic. Nasprotno pa so celice, ki so izražale ChR2, z ali brez svetlobe kazale zmanjšano viabilnost. Čeprav večina razlik ni bila statistično značilna, so bile nekatere razlike med posameznimi skupinami pomembne. Rezultati kažejo, da lahko optogenetska manipulacija vpliva na proliferacijo celic.

Apoptoza

Za preverjanje morebitne celične smrti so izvedli Annexin V/PI analizo s pretočno citometrijo. Rezultati niso pokazali statistično značilnih razlik med skupinami glede apoptoze ali nekroze. Delež živih celic je ostal primerljiv med vsemi skupinami. To pomeni, da optogenetska stimulacija ni povzročila pomembne citotoksičnosti, čeprav so bile opažene določene spremembe v proliferaciji celic.

Izražanje nevronskih genov

Glavni cilj raziskave je bil preveriti, ali optogenetska stimulacija spodbuja nevronsko diferenciacijo MSC preko izražanja specifičnih markerjev.

Nestin

Nestin predstavlja marker nevronskih progenitorjev. V BM-MSC se je njegovo izražanje v skupini ChR2 + svetloba značilno povečalo že po 24 urah in ostalo povišano tudi po 48 urah. Pri A-MSC so bili učinki še izrazitejši. Izražanje Nestina se je po 24 urah močno povečalo, po 48 urah pa je bilo povečanje še izrazitejše. Tretji dan po stimulaciji se izražanje ni več bistveno spreminjalo. Rezultati predstavljajo pomemben dokaz za indukcijo zgodnje nevronske diferenciacije.

β-tubulin III

β-tubulin III je marker nevronov. V BM-MSC se je njegovo izražanje povečalo po 48 urah v ChR2 skupinah. Pri A-MSC se je izražanje povečalo že po 24 urah v skupini ChR2 + svetloba in nato nadaljevalo naraščanje do 72 ur. Modra svetloba sama je po 24 urah povzročila zmanjšanje izražanja, ki se je kasneje normaliziralo. To kaže, da je učinek povečanega izražanja specifično povezan z optogenetsko aktivacijo.

Doublecortin (DCX)

DCX je marker migrirajočih nevronov. Pri celicah, izpostavljenih samo modri svetlobi, se je izražanje po 24 urah zmanjšalo, nato pa normaliziralo. V skupinah ChR2 + svetloba pa se je izražanje po 48 urah značilno povečalo in ostalo stabilno, kar kaže na aktivacijo procesov zgodnje nevronske diferenciacije.

NeuN

NeuN predstavlja marker zrelih nevronov. Pomembno povečanje njegove ekspresije so opazili predvsem v A-MSC, ki so izražale ChR2 in bile izpostavljene modri svetlobi. Pri skupinah, izpostavljenih samo modri svetlobi, se je izražanje sprva zmanjšalo, nato pa normaliziralo. Rezultati kažejo, da optogenetska stimulacija lahko vpliva tudi na kasnejše faze nevronske diferenciacije.

FACS analiza Nestina

S FACS analizo so preverili izražanje proteina Nestin 48 ur po stimulaciji. Pri BM-MSC se je v skupini, izpostavljeni samo modri svetlobi, delež pozitivnih celic zmanjšal, medtem ko se je v ChR2 skupini brez svetlobe povečal. Največje povečanje so opazili v skupini ChR2 + svetloba. Tudi pri A-MSC se je izražanje Nestina povečalo v vseh skupinah, največ v skupini ChR2 + svetloba. Rezultati dodatno potrjujejo, da optogenetska stimulacija poveča izražanje markerjev, povezanih z nevronsko diferenciacijo.

Zaključek

Raziskava je pokazala, da lahko optogenetska stimulacija predstavlja učinkovito alternativo oziroma dopolnitev klasičnim metodam za spodbujanje nevronske diferenciacije mezenhimskih matičnih celic. Rezultati so pokazali, da aktivacija ChR2 z modro svetlobo poveča izražanje ključnih nevronskih markerjev, kot so Nestin, β-tubulin III, DCX in NeuN. Poleg molekularnih sprememb so bile opažene tudi morfološke spremembe celic, ki podpirajo prehod v nevronsko podobno stanje. Posebej izrazit učinek je bil opažen pri A-MSC, kar nakazuje večji potencial teh celic za nevronsko diferenciacijo v primerjavi z BM-MSC. Pomembna ugotovitev raziskave je tudi, da optogenetska stimulacija ni povzročila statistično značilnega povečanja apoptoze ali citotoksičnosti, čeprav je vplivala na proliferacijo celic. Skupno rezultati kažejo, da optogenetika omogoča natančen nadzor diferenciacije matičnih celic in predstavlja obetavno orodje v regenerativni medicini. Nadaljnje raziskave bodo potrebne za preverjanje funkcionalnosti diferenciranih celic in njihove morebitne uporabe v klinični praksi.

Viri

1. Fereidounian, M.A., Bourbour, S., Shirkavand, A. et al.Effects of optogenetic stimulation on neural gene expression in human bone marrow and adipose-derived mesenchymal stem cells. BMC Biotechnol 26, 4 (2026). https://doi.org/10.1186/s12896-025-01083-0 2. Duebel, Jensa,b,c; Marazova, Katiaa,b,c; Sahel, José-Alaina,b,c,d,e,f. Optogenetics. Current Opinion in Ophthalmology 26(3):p 226-232, May 2015. | DOI: 10.1097/ICU.0000000000000140 3. Sivandzade, F., & Cucullo, L. (2021). Regenerative Stem Cell Therapy for Neurodegenerative Diseases: An Overview. International Journal of Molecular Sciences, 22(4), 2153. https://doi.org/10.3390/ijms22042153 4. Aithal AP, Bairy LK, Seetharam RN. Safety and therapeutic potential of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells in regenerative medicine. Stem Cell Investig. 2021 May 11;8:10. doi: 10.21037/sci-2020-036. PMID: 34124233; PMCID: PMC8173294. 5. Jung, K., Park, J.H., Kim, SY. et al. Optogenetic stimulation promotes Schwann cell proliferation, differentiation, and myelination in vitro.Sci Rep 9, 3487 (2019). https://doi.org/10.1038/s41598-019-40173-w