Cikel načrtovanja, izdelave, testiranja in učenja (DBTL) pri razvoju celičnega biosenzorja za piruvat na osnovi transkripcijskega faktorja

Izhodiščni članek: [1]

Uvod

Celični biosenzorji predstavljajo pomembno orodje v sintezni biologiji, saj omogočajo neposredno pretvorbo biokemijskih signalov v merljive biološke odzive v živih celicah. Njihova glavna prednost je možnost real-time spremljanja metabolitov, vendar pa njihovo delovanje pogosto omejujejo nizek dinamični razpon, visoko ozadno izražanje in omejena občutljivost. Te omejitve so še posebej izrazite pri biosenzorjih, ki temeljijo na transkripcijskih faktorjih, kjer natančno uravnavanje izražanja genov zahteva optimizacijo več medsebojno povezanih genetskih elementov. Napredek v sintezni biologiji omogoča sistematično optimizacijo takih sistemov z uporabo metod, ki temeljijo na statističnem načrtovanju eksperimentov. Med njimi je metoda Design of Experiments (DoE) še posebej uporabna, saj omogoča analizo vpliva več dejavnikov hkrati z bistveno manjšim številom eksperimentov, kot bi bilo potrebno pri klasičnem pristopu. V tej študiji je bil uporabljen celovit DBTL (Design–Build–Test–Learn) pristop za razvoj in optimizacijo biosenzorja za piruvat v bakteriji Escherichia coli ΔpdhR. Piruvat je osrednji metabolit v celični presnovi, zato je njegovo natančno zaznavanje pomembno za metabolično inženirstvo, optimizacijo produkcijskih poti in spremljanje celičnega stanja.

Rezultati

DBT cikel 1: konstrukcija osnovnega PdhR biosenzorja

V prvem DBT ciklu je bil zasnovan biosenzor na osnovi transkripcijskega regulatorja PdhR, ki deluje kot represor in se specifično odziva na prisotnost piruvata. Sistem je bil zasnovan tako, da koncentracija piruvata neposredno vpliva na izražanje reporterskega gena sfGFP, kar omogoča kvantitativno spremljanje znotrajceličnih koncentracij. Gen pdhR iz E. coli MG1655 je bil postavljen pod konstitutivni promotor PJ115, medtem ko je bil sfGFP pod nadzorom naravnega promotorja Ppdh, ki vsebuje vezavno mesto za PdhR. To omogoča, da PdhR v odsotnosti piruvata deluje kot represor, medtem ko njegova inaktivacija ob prisotnosti piruvata sprosti transkripcijo. Oba gena sta uporabljala enotno RBS30 sekvenco, kar je zagotavljalo stabilno translacijsko osnovo brez dodatnih variacij na ravni prevajanja. Genetsko vezje je bilo sestavljeno z metodo HiFi DNA assembly v plazmid pUC19 in vneseno v sev Escherichia coli ΔpdhR, s čimer je bil odstranjen vpliv endogenega regulatorja. S tem je bil zagotovljen čist odzivni sistem, v katerem je signal odvisen izključno od plazmidno kodiranega PdhR. Delovanje biosenzorja je bilo testirano v območju od 0,05 do 10 mM piruvata. Rezultati so pokazali jasno koncentracijsko odvisno povečanje fluorescence sfGFP, kar potrjuje funkcionalnost sistema. Optimalni čas meritve je bil določen pri 6 urah, saj je omogočal stabilen signal z minimalnim vplivom rasti. V tem času je biosenzor pokazal linearen odziv v območju 0,1 do 5 mM (R² = 0,97), kar je pomembno za kvantitativno uporabo. Meja zaznave je bila določena pri 0,05 mM, kjer je bila razlika v signalu statistično značilna (p < 0,001), kar kaže na visoko občutljivost osnovne konstrukcije.

Validacija hibridnega promotorja

Za preverjanje modularnosti regulatornega sistema je bil zasnovan hibridni promotor PJ106_PdhR box, ki združuje konstitutivni promotor in PdhR vezavno mesto. Namen tega koraka je bil analizirati, kako prisotnost PdhR vpliva na transkripcijsko aktivnost in ali sistem ohranja funkcionalno regulacijo. Primerjava sevov z in brez PdhR je pokazala jasno represivno delovanje regulatorja. V odsotnosti PdhR je bila ekspresija sfGFP znatno višja že v zgodnjih fazah rasti, kar potrjuje, da PdhR deluje kot močan transkripcijski represor. Po dodatku 10 mM piruvata se je izražanje povečalo v obeh sevih, vendar je razlika med njima ostala statistično značilna. To potrjuje, da piruvat sprosti represijo PdhR in ponovno aktivira transkripcijo. Ta validacijski korak je pokazal, da je regulatorni mehanizem stabilen in primeren za nadaljnjo optimizacijo, saj omogoča predvidljiv odziv na spremembe koncentracije liganda.

DBTL cikel 2: optimizacija z DoE

V drugem DBTL ciklu je bila izvedena sistematična optimizacija biosenzorja z uporabo delnega faktorskega načrta (resolution IV), katerega cilj je bil izboljšati dinamični razpon, zmanjšati ozadno izražanje in povečati razmerje ON/OFF.

Načrtovanje

V model so bili vključeni štirje ključni dejavniki, in sicer promotor P1 in RBS1 za gen pdhR ter promotor P2 in RBS2 za reporterski gen sfGFP. Vsak dejavnik je imel dve ravni izražanja, kar je omogočilo analizo 8 eksperimentalnih kombinacij namesto 16, s čimer se je eksperimentalna kompleksnost bistveno zmanjšala.

Izdelava

Sestavljenih je bilo osem genetskih variant, ki so se razlikovale v kombinacijah močnih in šibkih promotorjev ter RBS sekvenc. Ena varianta je služila kot referenčna kontrola z naravnim promotorjem Ppdh, kar je omogočilo primerjavo z osnovnim sistemom iz prvega cikla.

Testiranje

Odziv biosenzorjev je bil ocenjen z merjenjem fluorescence sfGFP pri različnih koncentracijah piruvata. Podatki so bili modelirani s Hillovo funkcijo, kar je omogočilo določitev ključnih parametrov, kot so OFF stanje, ON stanje in dinamični razpon. Variabilnost med konstrukti je pokazala, da genetske komponente močno vplivajo na razmerje signalov in stabilnost odziva.

Učenje

Statistična analiza je pokazala, da ima RBS2 največji vpliv na dinamični razpon, vendar v negativni smeri, saj povečuje ozadno izražanje v OFF stanju in hkrati zviša maksimalni signal v ON stanju, kar zmanjša kontrast sistema. RBS1 vpliva predvsem na amplitudo signala, medtem ko imata promotorja P1 in P2 manj izrazite učinke. Analiza interakcij je razkrila pomembno povezavo med P1 in RBS1, kar kaže na to, da je transkripcijska in translacijska regulacija medsebojno odvisna. Najboljši regresijski model, izbran na podlagi Akaikejevega informacijskega kriterija, je pokazal, da RBS2 negativno vpliva na sistem, medtem ko imata P1 in interakcija P1 × RBS1 pozitiven vpliv na dinamični razpon. Končna optimizirana varianta, označena kot varianta 6, je dosegla 18,54-krat večji dinamični razpon in 37,22-krat zmanjšano ozadno izražanje, kar predstavlja bistveno izboljšanje glede na začetno konstrukcijo.

Kvantifikacija piruvata v optimizirani varianti

Najboljša varianta je bila dodatno analizirana z vidika povezave med biosenzorskim signalom in dejanskimi koncentracijami piruvata. Zunajcelične koncentracije so bile analizirane v območju 0 do 100 mM z uporabo HPLC metode. Rezultati so pokazali, da so bile začetne koncentracije skladne z dodanimi vrednostmi, medtem ko se je po 6 urah inkubacije koncentracija zmanjšala za približno 20 mM, kar kaže na aktivno porabo piruvata. Znotrajcelični piruvat je naraščal sorazmerno z zunajcelično koncentracijo, kar potrjuje učinkovit transport v celico in metabolno vključevanje. Povezava med signalom GFP/OD in znotrajceličnim piruvatom je bila uspešno modelirana s Hillovo enačbo, pri čemer je bilo določeno operativno območje biosenzorja med 1,23 in 6,81 μmol/g DCW. To potrjuje visoko občutljivost sistema in njegovo uporabnost za spremljanje metabolnih sprememb v realnem času.

Diskusija

Raziskava je pokazala, da je mogoče z uporabo DBTL pristopa in statističnega modeliranja učinkovito razviti in optimizirati transkripcijski biosenzor za piruvat v Escherichia coli. V dveh ciklih je bil dosežen znaten napredek, predvsem v povečanju dinamičnega razpona in zmanjšanju ozadnega izražanja. V primerjavi z obstoječimi biosenzorji v drugih organizmih je bil razviti sistem bolj občutljiv in je deloval v širšem koncentracijskem območju. Ključna ugotovitev je, da se učinkovitost biosenzorja močno razlikuje glede na gostiteljski organizem zaradi razlik v metabolizmu piruvata. Metoda DoE se je izkazala kot zelo učinkovita, saj je omogočila identifikacijo ključnih genetskih dejavnikov z minimalnim številom eksperimentov. Čeprav so odzivi biosenzorja nelinearni, jih je bilo mogoče uspešno modelirati z linearno regresijo preko parametrov Hillove funkcije. RBS sekvence so bile identificirane kot ključni regulatorni element, kjer je RBS1 vplival na represijo, RBS2 pa na ravnovesje med signalom in ozadjem. Optimizacija translacijske učinkovitosti se je tako izkazala kot ključni dejavnik za izboljšanje biosenzorja. Poleg genetskih dejavnikov je pomembno tudi metabolno ozadje, saj različni substrati posredno vplivajo na raven piruvata in s tem na signal biosenzorja. To kaže, da biosenzor ne meri le neposredne koncentracije, temveč tudi integrirano metabolno stanje celice. Optimizirani biosenzor predstavlja potencialno orodje za metabolično inženirstvo, saj omogoča dinamično regulacijo metabolnih poti, optimizacijo proizvodnje spojin iz piruvata in selekcijo učinkovitih sevov. Njegova modularna zasnova omogoča nadaljnje razširitve in prilagoditve.

Metode

Za kloniranje je bil uporabljen sev Escherichia coli DH5α, za funkcionalno testiranje pa sev ΔpdhR. Genetske konstrukte so sestavili v plazmidu pUC19 z metodo HiFi DNA assembly in jih vnesli v celice z elektroporacijo. Biosenzor so testirali v M9 minimalnem gojišču z različnimi koncentracijami piruvata, pri čemer so po 6 urah merili fluorescenco GFP in optično gostoto ter podatke normalizirali glede na rast celic. Zunajcelični piruvat je bil določen s HPLC, znotrajcelični pa po ekstrakciji celic z metanol-vodno raztopino in cikli zamrzovanja ter odmrzovanja, nato analiziran z encimskim testom in normaliziran na suho celično maso. Statistična analiza je vključevala ANOVA, t-test, linearno regresijo in Hillovo funkcijo, modeli pa so bili ovrednoteni z Akaikejevim informacijskim kriterijem z uporabo programov R, JMP in GraphPad Prism.