Fagni infekcijski cikel v sintetičnih celicah

Izhodiščni članek: [ https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8 A synthetic cell phage cycle]

Uvod

Sintezna biologija od spodaj navzgor

Sintezna biologija se ne ukvarja samo s spreminjanjem že obstoječih živih organizmov, ampak tudi z vprašanjem, kako lahko biološke procese zgradimo iz osnovnih molekularnih komponent. Tak pristop imenujemo gradnja od spodaj navzgor. Njegova prednost je, da lahko raziskovalci posamezne biološke procese preučujejo v bolj nadzorovanem okolju kot v živi celici. V bakteriji namreč hkrati potekajo številni procesi, kot so presnova, rast, delitev, popravljanje DNA, regulacija genov in obrambni sistemi. Zaradi tega je v živem organizmu pogosto težko določiti, kateri dejavnik neposredno vpliva na opazovani pojav. V tej raziskavi so avtorji želeli rekonstruirati celoten infekcijski cikel bakteriofaga T7 v sinteznih celicah. Bakteriofagi so virusi, ki okužujejo bakterije. Fag T7 naravno okužuje bakterijo Escherichia coli in spada med najbolje raziskane bakteriofage. Njegov infekcijski cikel je litičen, kar pomeni, da se fag najprej veže na površino bakterije, nato v celico vnese svoj genom, ta genom se izraža in replicira, nastanejo novi fagni delci, na koncu pa se bakterijska celica razgradi oziroma lizíra in sprosti potomne fage.

Namen raziskave

Posebnost te raziskave je, da avtorji fagnega cikla niso rekonstruirali v živi bakteriji, ampak v umetno pripravljenih liposomih, ki so delovali kot sintezne celice. Te celice niso bile prave žive celice, saj niso imele lastnega metabolizma, rasti ali delitve. Vseeno pa so vsebovale sistem za izražanja genov, imenovan CFE. Ta sistem vsebuje molekule, encime, ribosome, aminokisline, nukleotide in energijske komponente, ki omogočajo transkripcijo in translacijo. Če v tak sistem pride DNA, se lahko iz nje sintetizirajo RNA in proteini. Glavni cilj raziskave je bil pokazati, da lahko fag T7 okuži sintetično celico, vanjo vnese svoj genom, sproži njegovo izražanje in replikacijo ter omogoči nastanek novih infektivnih fagnih delcev. S tem so avtorji želeli dokazati, da je mogoče kompleksen virusni življenjski cikel rekonstruirati zunaj žive celice, v poenostavljenem, vendar funkcionalnem sistemu.

Priprava sinteznih celic

Zasnova membrane in uporaba RdLPS

Prvi pomemben korak je bil pripraviti umetne celice, na katere se fag T7 lahko specifično veže. V naravi se bakteriofagi vežejo na receptorje na površini bakterij. Pri E. coli so takšni receptorji pogosto povezani z zunanjo membrano, predvsem z lipopolisaharidi oziroma LPS. Avtorji so zato v membrano liposomov vključili posebno obliko LPS, imenovano RdLPS. Gre za krajšo obliko grobega LPS, ki vsebuje samo notranje jedro. Izbrali so jo zato, ker je manjša in bolj hidrofobna kot daljše oblike LPS, zato jo je lažje stabilno vključiti v lipidno membrano.

Vključitev LPS v liposome ni bila preprosta. LPS ima veliko molekulsko maso in ni popolnoma kompatibilen s fosfolipidi. Poleg tega je bilo pomembno, da je RdLPS vgrajen predvsem v zunanji sloj membrane, kjer lahko deluje kot receptor za fag. Če bi bil v večji meri prisoten na notranji strani membrane, bi lahko inaktiviral novo nastale fage znotraj sintezne celice.

Umetno narejene celice so pripravili iz treh glavnih komponent: POPC, PE-PEG in RdLPS. POPC je tvoril osnovo membrane, PE-PEG je preprečeval agregacijo liposomov, RdLPS pa je omogočal vezavo faga T7. Najboljša sestava membrane je bila PC/PE-PEG/LPS v razmerju 55/15/30 molskih odstotkov pri skupni koncentraciji lipidov 100 µM. S to sestavo so dobili stabilno populacijo liposomov s premeri od 1 do 50 µm.

Preverjanje delovanja membrane z RdLPS

Delovanje RdLPS so preverili s himernim proteinom GFP-TF*. Ta protein vsebuje fluorescenčni GFP in del repnega proteina faga T7, ki prepoznava RdLPS. Če je RdLPS pravilno vgrajen v membrano, se GFP-TF* veže na površino liposoma in membrana zasveti zeleno.

Avtorji so pripravili dva tipa liposomov: ene z RdLPS in druge brez RdLPS. Po dodatku GFP-TF* se je fluorescenčni signal pojavil samo na liposomih z RdLPS. To je potrdilo, da je vezava specifična in da je RdLPS funkcionalno prisoten na površini. Hkrati so pokazali, da RdLPS ne zavira delovanja CFE sistema v notranjosti liposomov. To so dokazali z izražanjem reporterskega gena mcherry, ki povzroči rdečo fluorescenco.

Za dodatno potrditev so uporabili inženiran fag T7-Split-S*. Ta fag je imel repne proteine, ki prepoznavajo RdLPS, poleg tega pa je omogočal fluorescenčno označevanje kapsidnih proteinov preko sistema split-GFP.

Vstop in izražanje fagnega genoma

Vstop genoma in izražanje mCherry

Ko so dokazali, da se fag T7 lahko veže na umetne celice, je bilo naslednje vprašanje, ali lahko vanje vnese svoj genom. Pri fagu T7 je ta proces poseben, ker ima kratek nekrčljiv rep. Zaradi tega ne more preprosto prebosti membrane z dolgim repom, ampak po vezavi sprosti notranje jedrne proteine, ki pomagajo oblikovati kanal za prenos DNA. Za popoln prenos genoma je pomembna tudi RNA-polimeraza T7.

Za dokaz vstopa genoma so uporabili inženirana faga T7-mC-WT in T7-mC-S*. Oba sta nosila reporterski gen mcherry, vendar je imel T7-mC-S* repna vlakna, ki prepoznavajo RdLPS, T7-mC-WT pa ne. Logika poskusa je bila jasna: če fag vnese svoj genom v liposom, se v notranjosti začne izražati mcherry in liposom zasveti rdeče.

Po dodatku T7-mC-S* se je v notranjosti RdLPS sinteznih celic pojavil rdeč fluorescenčni signal. To pomeni, da je fagni genom vstopil v liposom, se začel izražati in omogočil sintezo proteina mCherry. Kontrolni fagi, ki se niso mogli specifično vezati na RdLPS ali niso imeli ustreznega reporterja, niso dali signala nad ozadjem. S tem so dokazali, da je vstop genoma odvisen od RdLPS.

Literatura

[1] Levrier, A., Soudier, P., Garenne, D., Izri, Z., Bowden, S., Lindner, A. B., & Noireaux, V. (2026h). A synthetic cell phage cycle. Nature Communications 2026 17:1, 17(1), 557-. https://doi.org/10.1038/s41467-025-67249-8