Avtonomna biogeneza vseh tridesetih proteinov translacijskega sistema E. coli

Izhodiščni članek: Autonomous biogenesis of all thirty proteins of the Escherichia coli translation machinery

Uvod

En izmed ključnih izzivov sintezne biologije je ustvariti minimalni umetni celični sistem, ki bi bil sposoben obnavljanja lastnih transkripcijskih proteinov. Znanstveniki so raziskovali možnost avtonomne biogeneze vseh tridesetih proteinskih komponent translacijskega sistema E. coli v popolnoma rekonstituiranem brezceličnem sistemu. Njihovo delo predstavlja pomemben korak pri razvoju sintetičnih celic, saj translacijski aparat s sintezo proteinov omogoča razmnoževanje bioloških sistemov [1]. PURE (angl. protein synthesis using recombinant elements) predstavlja minimalni brezcelični translacijski sistem, sestavljen iz izoliranih ribosomov, translacijskih faktorjev, aminoacil-tRNA sintetaz, RNA polimeraze in drugih komponent za pretvorbo DNA v proteine [2]. Ob dodatku zapisa DNA je sposoben transkripcije in translacije. Če dodamo zapise za proteine, ki so esencialni za translacijo, in reporterski gen, lahko dokažemo sposobnost samoobnavljanja sistema. En izmed glavnih problemov sistema je, da ta vsebuje visoke začetne koncentracije translacijskih proteinov, zato prispevka novo sintetiziranih proteinov ni mogoče zanesljivo zaznati. Cilj raziskave je bil določiti pogoje, pri katerih novo nastali proteini neposredno vplivajo na nadaljnjo translacijo in s tem dokazati sposobnost samoobnavljanja [1].

Določanje minimalnih koncentracij translacijskih proteinov

V naboru tridesetih proteinov esencialnih za translacijo je bilo dvajset aminoacil-tRNA sintetaz, ki katalizirajo vezavo aminokislin na ustrezne tRNA, ter deset translacijskih faktorjev, ki so vključeni v iniciacijo, elongacijo in terminacijo translacije. Osnovna hipoteza je bila, da bi lahko pri dovolj nizkih začetnih koncentracijah posameznih komponent novo sintetizirani proteini ponovno vstopili v sistem in povečali njegovo aktivnost, kar bi omogočilo samoojačevanje translacije. Računalniške simulacije translacijskega sistema pri različnih koncentracijah translacijskih proteinov so pokazale, da je pri močno razredčenem PURE sistemu translacijska aktivnost zelo občutljiva na koncentracijo posameznih komponent. Ko koncentracija določenega proteina pade pod pragovno vrednost, se translacija skoraj popolnoma ustavi. Če sistem vsebuje gen za manjkajoči protein, lahko novo sintetizirani proteini presežejo pragovno koncentracijo in sprožijo hitro povečanje translacijske aktivnosti. Ta pojav predstavlja osnovo avtokatalitične biogeneze translacijskega aparata [1]. Na podlagi simulacij so raziskovalci eksperimentalno določili pragovne koncentracije za vsak translacijski protein. Za vsako komponento so pripravili različico PURE sistema, v kateri je bil izbran protein odstranjen ali prisoten v zelo nizki koncentraciji. Kot indikator translacijske aktivnosti so uporabili gen za zeleni fluorescenčni protein (GFP). Če je dodatek gena za manjkajoči protein povečal sintezo GFP, je bil novo nastali protein funkcionalen in se je uspešno vključil v translacijski aparat. Pri večini aminoacil-tRNA sintetaz so uspešno dokazali samoobnavljanje. Na primer, pri valil-tRNA sintetazi (ValRS) je dodatek gena za ValRS povzročil znatno povišanje hitrosti sinteze GFP, kar je dokazalo, da novo sintetizirana ValRS deluje pravilno. Opazen je časovni zamik pri povečanju obsega translacije. Sprva je translacija potekala počasi zaradi nizke koncentracije začetnega encima, nato pa je po dosegu pragovne koncentracije novo sintetiziranega proteina prišlo do izrazitega povišanja hitrosti translacije, kar potrjuje obstoj pozitivne povratne zanke. Pri nekaterih translacijskih faktorjih so raziskovalci naleteli na težave zaradi kontaminacije ribosomskih izolatov z ostanki translacijskih proteinov. Predvsem iniciacijski in terminacijski faktorji so bili prisotni v zadostnih količinah, da so omogočali translacijo tudi v sistemih, kjer bi naj bili odstranjeni. Masna spektrometrija je pokazala, da so ribosomski izolati vsebovali ostanke nekaterih translacijskih proteinov, kar je oteževalo dokazovanje samoobnavljanja. Da bi zmanjšali vpliv kontaminacije, so uporabili komercialno pripravljene ribosome [1].

Površinsko imobilizirani skupki DNA

Težavno je bilo določiti pragovno vrednost elongacijskega faktorja EF-Tu, saj ni bilo mogoče zanesljivo razlikovati prispevka začetno dodanega proteina od prispevka novo sintetiziranega EF-Tu. To je posledica široke dinamične odzivne funkcije translacijskega sistema, kjer se GFP signal na spremembe koncentracije EF-Tu odziva kontinuirano v razponu od nanomolarnih do mikromolarnih vrednosti, brez natančno definiranega praga. Zaradi takšne odvisnosti med koncentracijo EF-Tu in učinkovitostjo translacije, razlike v koncentraciji ne povzročijo diskretnega prehoda med neaktivnim in aktivnim stanjem, ampak le postopno spremembo signala. Prispevki začetnega in nastalega EF-Tu se tako prekrivajo, kar onemogoča eksperimentalno določitev v enostopenjskem sistemu. Problem so rešili z dvostopenjskim sistemom. V prvem koraku so razredčenemu PURE sistemu dodali gen za EF-Tu, nato pa so del reakcijske mešanice prenesli v drugo reakcijo z genom za GFP. Potrdili so, da je novo sintetiziran EF-Tu funkcionalen, saj se je signal v drugem koraku višal s koncentracijo gena za EF-Tu v prvem [1]. Da bi omogočili samoobnavljanje EF-Tu pri nižjih koncentracijah, so raziskovalci ustvarili prostorsko organizirane reakcijske skupke z uporabo površinsko imobiliziranih DNA. Gene za translacijske proteine so pritrdili na površino v visoki gostoti, kar je ustvarilo območja z visoko navidezno koncentracijo DNA, mRNA in novo sintetiziranih proteinov. Takšna prostorska organizacija je omogočila učinkovitejšo translacijo tudi pri zelo nizkih začetnih koncentracijah proteinov. Pristop deluje kot celična kompartmentalizacija, ampak brez fizične membrane. S pomočjo imobilizirane DNA so raziskovalci uspeli doseči hkratno samoregeneracijo translacijskih proteinov. Najprej so uspešno dokazali simultano biogenezo vseh treh elongacijskih faktorjev, nato pa še vseh dvajset aminoacil-tRNA sintetaz. V klasični raztopini takšna hkratna biogeneza ni bila mogoča, saj je skupna obremenitev translacijskega sistema presegla njegove zmogljivosti. Lokalizirani reakcijski centri so omogočili zadostno kopičenje novo sintetiziranih proteinov tako, da je sistem presegel prag translacijske aktivnosti, ki je potrebna za določitev funkcionalnosti novo nastalih komponent [1].

Vpliv prostorske organizacije na samoregeneracijo translacijskega sistema

V nadaljevanju so znanstveniki analizirali dejavnike, ki vplivajo na uspešnost samoregeneracije posameznih aminoacil-tRNA sintetaz. Določili so zmerno negativno korelacijo med učinkovitostjo translacije ter dolžino kodirajočega zaporedja in hidrofobnostjo substratne aminokisline. Daljši proteinski produkti povečujejo verjetnost neustreznega zvitja ali agregacije v razredčenem PURE sistemu. Hkrati so določili pozitivna povezava med uspešnostjo samoregeneracije in učinkovitostjo izražanja posameznega encima, kar vključuje vplive optimalnosti kodonov, stabilnosti mRNA ter kinetike translacijskega elongacijskega cikla. Rezultati tako kažejo, da je učinkovitost samoregeneracije določena s kombinacijo strukturnih lastnosti proteinov in translacijskih kinetičnih omejitev [1]. Pri najzahtevnejšem eksperimentu so bili v skupke imobilizirane DNA vključeni geni vseh tridesetih translacijskih proteinov hkrati. Po dodatku močno razredčenega PURE sistema je prišlo do izrazitega fluorescentnega signala v bližini DNA struktur, kar odraža povečano translacijsko aktivnost v lokacijah z visoko gostoto genetskega materiala. Novo sintetizirani proteini so v teh pogojih prispevali k lokalnemu povečanju koncentracije funkcionalnih komponent translacijskega aparata, kar je omogočilo preseganje pragovne koncentracije potrebne za določitev prispevka novo nastalih proteinov. S tem je bila potrjena hkratna biogeneza celotnega proteinskega nabora translacijskega sistema bakterije E. coli v rekonstituiranem brezceličnem sistemu [1]. Pomemben del raziskave predstavlja neposredna vizualizacija lokalizacije novo sintetiziranih proteinov. Z uporabo GFP-fuzijskih konstruktov za izbrane translacijske faktorje in fluorescenčne TIRF mikroskopije so analizirali njihovo prostorsko porazdelitev glede na imobilizirane DNA skupke. Rezultati kažejo akumulacijo translacijskih komponent v neposredni bližini njihovih kodirajočih zaporedij, kar vodi v nastanek lokaliziranih reakcijskih mikrookolij. Takšna prostorska organizacija zmanjšuje difuzijske omejitve, povečuje verjetnost interakcij med komponentami in posledično povečuje učinkovitost translacije [1].

Zaključek

Rezultati raziskave imajo velik pomen za področje sintezne biologije in razvoja umetnih celic. En izmed ključnih ciljev sintezne biologije je ustvariti sistem, ki bi bil sposoben samostojne rasti, vzdrževanja in razmnoževanja. Za dosego tega cilja mora celica imeti translacijski aparat sposoben samoobnove. Delo predstavlja pomemben dokaz, da je mogoče vzpostaviti avtokatalitični translacijski sistem, kjer novo sintetizirani proteini prispevajo k nadaljnji sintezi proteinov. Ob tem raziskava poudarja pomen prostorske organizacije biokemijskih reakcij. V celicah so procesi organizirani v specifičnih regijah, kar povečuje njihovo učinkovitost. Skupki imobilizirane DNA predstavljajo preprost model takšne organizacije in kažejo, da je prostorska lokalizacija komponent ključna za delovanje kompleksnih bioloških sistemov. Ta koncept bi lahko uporabili tudi pri razvoju umetnih metabolnih ciklov ali genetskih sistemov. Rezultati še ne predstavljajo popolnoma samozadostnega organizma, saj je sistem še vedno odvisen od zunanjega dovajanja energije, ribosomov in številnih drugih komponent, kjer se ponuja možnost za dodaten razvoj.

Literatura

[1] M. Schwarz-Schilling, I. Cohen, A. Dupin, N. Avidan, Y. Barak, Y. Shimizu, S. S. Daube, R. H. Bar-Ziv: Autonomous biogenesis of all thirty proteins of the Escherichia coli translation machinery. Nat. Commun. 2025, 17, 1028. DOI: 10.1038/s41467-025-67772-8

[2] Y. Shimizu, T. Kanamori, T. Ueda: Protein synthesis by pure translation systems. Methods 2005, 36, 299–304. DOI: 10.1016/j.ymeth.2005.04.006