Reprogramiranje z dvema faktorjema

Uvod

Inducirane pluripotentne matične celice (iPSCs) so proizvedene iz že diferenciranih celic z dediferenciacijo. Nastanek induciranih pluripotentnih celic je mogoč z izražanjem določenih transkripcijskih faktorjev. Seznam je na začetku obsegal 24 faktorjev, ki pa so ga uspeli skrčiti na le štiri faktorje.

Faktorji

Največkrat gre za omembo Yamanaka faktorjev Oct4, c-Myc, Klf4 in Sox2, poimenovanih po njihovem odkritelju. Izražanje teh štirih faktorjev je bilo zadostno za pridobitev induciranih pluripotentnih celic. Kasnejše raziskave so doprinesle spoznanje, da niso potrebni niti štirje faktorji. Težnja po odkritju metode, ki bi potrdila, da je tudi manj faktorjev zadostnih za pluripotentnost celic je bila velika zaradi vsaj dveh razlogov. Manj vključujočih faktorjev bi pomenilo tudi manj tveganj in manj komplikacij. Hkrati pa so želeli izključiti onkogene faktorje, kot sta Klf4 in c-Myc. Z raziskavami so ugotovili, da sta dovolj tudi le dva od Yamanaka faktorjev, katerih izbira ni poljubna. Delovanje faktorjev Klf4, Oct4 in Sox2 je kooperativno, delujejo na iste tarčne gene. C-Myc pa deluje na povsem druge tarčne gene in tu ni v povezavi z ostalimi faktorji. Že to nakazuje na večjo možnost zamenjave faktorja c-Myc, kot pa katerega od ostalih faktorjev, ki so v sodelovanju in vplivajo na iste gene.

• Oct4

Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4). Oct4 je pri ljudeh kodiran z genom POU5F1. Regulacija tega gena je zelo pomembna pri vzdrževanju stanja pluripotentnosti. Prevelika ali premajhna količina Oct4 povzroči diferenciacijo celice, kar pomeni izgubo pluripotentnosti. Faktorja Oct4 in Klf4 sta dovolj za pridobitev iPSCs.

• Sox2

SRY (sex determining region Y) box 2 ali Sox2. Primarna vloga faktorja Sox2 je vpliv na izražanje Oct4. Faktorja tvorita heterodimer in se kooperativno vežeta na DNA na nepalindromskih zaporedjih. S tem aktivirata faktorje za zagotovitev pluripotentnosti. Sox2 pa vpliva tudi na tarčni gen Nanog, ki je povezan s pluripotentnostjo. Kombinacija dveh faktorjev Sox2 in Oct4 je bila pri človeških fibroblastih ugotovljena za primerno in zadostno pri zagotavljanju pluripotentnosti iPSCs. Izguba pluripotentnosti pri faktorju Sox2 in Oct4 je regulirana s hipermetilacijo nekaterih vezavnih mest Sox2 in Oct4 v moških zarodnih celicah.

• c-Myc

c-Myc ima vlogo pri nastanku iPSCs, saj sodeluje pri acetilaciji histonov. Lastnost tega faktorja je, da je onkogen. Temu je tudi sledil trend, da se odkrije način proizvajanja iPSCs pri katerih omenjenega faktorja ne bi bilo potrebno izraziti/uporabiti.

• Klf4

Kruppel-like factor 4, je pri ljudeh zapisan z genom KLF4. V četverki faktorjev za pluripotentnost celic so ga uspeli nadomestiti.

Reprogramiranje celic, ki endogeno že izražajo enega ali več faktorjev

Prvi način, kako pridobiti iPS celice brez uporabe c-Myc in Klf4, je uporaba celic, ki ta dva faktorja izražajo endogeno

Reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic z uporabo dveh faktorjev

Odrasle živčne matične celice so se izkazale kot primerne, saj endogeno izražajo višje ravni Sox2 in c-Myc, kot pa zarodne matične celice. Izražajo tudi Klf4. Višje izražanje Sox2 naj bi zagotavljalo matičnost in jo pomagalo vzdrževati. Predvideva se, da Sox2 nadzira izražanje Oct4. Živčne matične celice se lahko razvijejo v astrocite, oligodendrocite in nevrone. Lahko jih izoliramo iz zarodka, odraslega ali post mortem. Izmed petnajstih preizkušenih kombinacij so iPS celice nastale le pri parih Oct4 in Kfl4 ter paru Oct4 in c-Myc. Par Oct4 in Kfl4 se je izkazal kot potencialno zanimiv, ker za njegovo pripravo ni potreben c-Myc ter tako ne povzroča nastanka tumorjev v potomcih in tako iPS celice približuje klinični uporabi. Raziskava je bila najprej izvedena na mišjih živčnih matičnih celicah, nato pa so metodo kot uspešno potrdili še na človeških živčnih matičnih celicah.

Reprogramiranje celic dermalne papile z uporabo dveh faktorjev

Živčne matične celice so težje dostopne, za njihovo pridobitev so včasih potrebni invazivni postopki. Kot alternativa se ponujajo celice dermalne papile, specializirani fibroblasti. Nahajajo se v koži na meji med dermisom in epidermisom. So lažje dostopni in tudi zanje je bilo ugotovljeno, da endogeno izražajo Sox2 in c-Myc ter Klf4. Raziskava je pokazala, da jih je možno dediferncirati z uporabo štiri, treh Oct4, Klf4 in c-Myc brez endogeno izraženega Sox2, ter dveh faktorjev, in sicer Oct4 in Klf4. Časi, potrebni za dediferenciacijo s štirimi, tremi in dvema faktorjema, so primerljivi s časi, potrebnimi za dedifernciacijo odraslih živčnih matičnih celic. Se pa iPS celice, pridobljene iz dermalnih papil, razlikujejo od iPS celic, pridobljenih iz odraslih živčnih matičnih celic, v tem, da imajo promoter za faktor Nanog hipometiliran.

Reprogramiranje mišjih odraslih živčnih matičnih celic z uporabo enega faktorja

Ker je bilo ugotovljeno, da odrasle živčne matične celice izražajo tri izmed štirih faktorjev, vse razen Oct4, so raziskovalci poskusili pridobiti iPS celice samo z ekspresijo Oct4. Že od samega začetka raziskovanja faktorjev, ki ločujejo embrionalne celice od ostalih celic, ki niso pluripotentne, se na podlagi profila izražanja zdi, da ima Oct4 glavno vlogo pri pluripotentnosti celic. Odrasle živčne matične celice so po indukciji Oct4 z retrovirusom postale iPS celice po štirih do petih tednih, izkoristek pa je bil v primerjavi s tistimi, pridobljenimi z dvema faktorjema (Oct4 in Klf4) slabši za desetkrat. Southern blot analiza je pokazala, da enofaktorske celice (Oct4) vsebujejo dve ali pet virusnih integracij, medtem ko so dvofaktorske(Oct4 in Klf4) in štirifaktorske (Oct4, Kfl4, Sox2 in c-Myc) vsebovale po sedem virusnih integracij. To pomeni, da je pri enofaktorskih celicah manjši poseg v sam genom celic in s tem tudi manjše tveganje za neželene posledice. Pluripotentnost je bila v nadaljevanju potrjena z nastankom teratomov po indukciji enofaktorskih celic v golo miš in mikroinjeciranjem v mišje blastociste, kjer so enofaktorske celice prispevale k nastanku vseh treh zarodnih plasti, številnih organov in tudi gamet. Vse to kaže,da imajo tako pridobljene enofaktorske celice enako pluripotentnost kot embrionalne matične celice. Raziskave so bile narejene tako na miših kot na človeških odraslih živčnih matičnih celicah.

Reprogramiranje celic, ki endogeno ne izražajo reprogramirajočih faktorjev

Kot vidimo, lahko za reprogramiranje odraslih živčnih matičnih celic (NSC) uporabimo samo Oct4 in Klf4. Ampak te celice že endogeno izražajo Sox2. Ugotovili pa so, da Oct4 in Klf4 zadostujeta tudi za reprogramiranje mišjih embrionalnih fibroblastov (MEF).

Reprogramiranje brez uporabe c-Myc

Reprogramiranje celic lahko izboljšajo molekule, ki sodelujejo v organizaciji kromatina. Učinkovitost lahko rahlo povečajo (2-5-krat) inhibitorji DNA metiltransferaze ter histon deacetilaze (HDAC). Primer takšnih inhibitorjev so 5`-azacitidin (5-azaC) in valproična kislina (VPA). Iz tega lahko sklepamo, da so spremembe kromatina ključni korak pri reprogramiranju fibroblastov v pluripotentne celice. Ta sklep je bil uporabljen pri reprogramiranju MEF brez uporabe c-Myc, ki drugače poteka z zelo majhno učinkovitostjo - inducira se manj kot 0,001% celic. Če pa poleg treh faktorjev dodamo tudi 5`-azacitidin oz. VPA lahko to učinkovitost povečamo. Izkazalo se je da 5`-azacitidin poveča učinkovitost 3-krat, VPA pa tudi do 50-krat. Pri tem VPA ne vpliva na spremembo iPSC – te ostanejo podobne mišjim embrionalnim matičnim celicam (MESC).

Reprogramiranje brez uporabe Sox2

Yan Shi in sodelavci so ugotovili, da je možno tudi reprogramiranje MEF z uporabo samo dveh faktorjev – Oct4 in Klf4. V poskusih, ki so jih izvedli na MEF, so ugotovili, da najbolj uspešno lahko nadomestijo Sox2 z uporabo kombinacije dveh molekul – BIX-01294 (BIX) in BayK8644 (BayK). BIX deluje na epigenetskem nivoju in ima široko območje aktivnosti. Zato so naredili poskus, katerega namen je bil odkriti še dodatne molekule, ki bi lahko izboljšale delovanje BIX in specificirale delovanje na izražanje Sox2. V osnovno gojišče so dodali BIX po virusni transdukciji celic z Oct4/Klf4 ter takšne celice obdelovali z različnimi molekulami. Ugotovili so, da je bila najbolj uspešna kombinacija BIX in BayK. Ta kombinacija je povečala število kolonij, ki so bile morfološko zelo podobne MESC. BayK nima nikakršnega učinka na reprogramiranje v odsotnosit BIX in ne deluje na epigenetskem nivoju, ampak na prenos signala. To je prva molekula za katero se je izkazalo da vpliva na reprogramiranje, ne deluje pa na epigenetskem nivoju. Takšna molekula bi lahko delovala bolj specifično kot pa molekule, ki delujejo direktno na spremembo DNA in histonov (BIX, VPA in 5`-azacitidin).

Dediferenciacija celic z reaktivacijo Oct-3/4 gena

Lahko naredimo še en korak dalje, namreč nadomestimo lahko tudi uporabo Oct4. Ker BIX-01294 omogoča reprogramiranje NPC z Klf4/Sox2/c-Myc sklepamo da lahko v tem primeru nadomesti uporabo Oct4. Oct-3/4 gen se izraža med gametogenezo in v zgodnjih embrionalnih celicah, kjer ima pomembno vlogo pri vzdrževanju pluripotentnosti. Med diferenciacijo celic pride do inhibicije tega gena. V tem procesu pomembno vlogo igra G9a histon metil transferaza (HMTaza) - vključena je v deacetilacijo histonov v regiji promotorja, lahko di- ali tri-metilira Lys 9 na histonu 3 (H3K9) ter na promotor prinese de novo DNA metilaze. Slednja vloga je zelo pomembna, ker so ugotovili da je ravno de novo metilacija ključna ovira za z Oct-3/4 posredovano dediferenciacijo. BIX-01294 inhibira G9a HMTazo in na ta način omogoča ponovno izražanje Oct-3/4 v že diferenciranih celicah.

Viri

• Yan Shi et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. Cell Press, 2008, letn.3, str. 568-574
• Kubicek S. et al. Reversal of H3K9me2 by a Small-Molecule Inhibitor for the G9a Histone Methyltransferase. Molecular Cell, 2007, letn.25, str. 473-481
• Feldman N. et al. G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis. Nature Cell Biology, 2006, letn.8, št.2
• Jeong Beom Kim et al., Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors, Nature, 2008, letn. 454 št. 7204, str. 646-651
• Su-YiTsai et al., Oct4 and Klf4 Reprogram Dermal Papilla Cells Into Induced Pluripotent Stem Cells, StemCells, 2010, letn. 28, št. 2, str. 221-228
• Jeong Beom Kim et al., Oct4-Induced Pluripotency in Adult Neural Stem Cells, Cell, 2009, letn. 136, št. 3, str. 411-419
• Wikipedia, Induced pluripotent stem cells, 2.5.2013, citirano [25.5.2013]