Reprogramiranje z miRNA

Uvod

Generiranje induciranih pluripotentnih matičnih celic (iPSC) običajno poteka s transkripijskimi faktorji, raziskave pa kažejo, da je reprogramiranje z miRNA učinkovitejše in tudi hitrejše. Glede na delovanje miRNA v različno diferenciranih celicah so bili na podlagi poskusov predlagani mehanizmi potrebnih procesov, njihova regulacija in prednosti in slabosti takega načina reprogramiranja somatskih celic.

MikroRNA

MikroRNA so kratke nekodirajoče RNA, ki regulirajo izražanje genov ali s promocijo razgradnje vezanega transkripta ali z inhibicijo njegovega prepisa.

Biosinteza in funkcija

Gene z zapisom za miRNA večinoma prepisuje RNA polimeraza II, izjemoma pa tudi RNA polimeraza III. Prepis s 5' kapo in poli-A repom (pri-miRNA) tvori lasnično zanko, ki jo prepozna jedrni protein DGCR8. Ta nato usmeri RNazo Drosha, da odcepi s stebla miRNA približno 11 nukleotidov skupaj s 5' kapo in poli-A repom. Nastala pre-miRNA se preko eksportina-5 prenese v citoplazmo, kjer endonukleaza Dicer odcepi zanko, ki povezuje 5' in 3' konca. Ena od verig nastalega dupleksa se vgradi v z RNA spodbujeni utiševalni kompleks (RISC), v katerem pride do interakcije miRNA s tarčno mRNA in s tem regulacije izražanja genov.

Med fiziološkimi procesi, ki jih uravnavajo miRNA, so celični cikel, diferenciacija celic in embrionalni razvoj vretenčarjev. Glede na funkcijo v teh procesih lahko razdelimo družine miRNA na pro-pluripotentne in pro-diferencijske. Slednje vplivajo na translacijo transkripcijskih faktorjev pomembnih za izražanje pro-pluripotentnih družin miRNA (Klf4, Oct4, Nanog, Sox2) in epigenetsko promovirajo metilacijo kromatina.

Pro-pluripotentne družine

Pro-pluripotentne družine so močneje zastopane v embrionalnih matičnih celicah, po diferenciaciji pa njihova koncentracija močno pade. Mednje sodijo vsi predstavniki klastrov (več sorodnih družin miRNA) miR-302/367 in miR-290/295.

miR-302/367 in miR-290/295 neposredno in posredno sodelujeta v več ključnih procesih aktivacije in ohranjanja pluripotenčnih matičnih celic. Za vzpostavljenje in ohranjanje pluripotence so ključne uravnotežene koncentracije osrednjih transkipcijskih faktorjev Oct4, Sox2 in Nanog, ki so avtoregulirane preko miRNA. Na Oct4, Sox2 in Nanog so zelo ohranjena vezavna mesta za promotorje miR-302/367 in miR-290/295. Omenjeni transkripcijski faktorji tako aktivirajo izražanje pro-pluripotentnih miRNA. miR-302/367 inhibira prepis genov odgovornih za diferenciacijo in epigenetsko promovira izražanje osrednjih transkripcijskih faktorjev ter tako zaključi pozitivno povratno zanko.

Oct4, Sox2 in Nanog zasedejo tudi promotorje pro-diferenciacijskih miRNA in razvojnih genov ter tako represirajo njihovo izražanje in s tem diferenciacijo.

Reprogramiranje z miRNA

Tako v embrionalnih matičnih celicah (ESC) kot v iPSC je bila opažena povečana koncentracija miR-302/367 in miR-290/295 v primerjavi z diferenciranimi celicami, kar je vzbudilo zanimanje. Embrionalne matične celice, ki niso bile sposobne procesiranja miRNA, so izgubile tudi pluripotentnost, kar je nakazovalo na aktivno udeležbo miRNA pri ohranjanju pluripotence. Izkazalo se je, da je reprogramiranje celic s transkripcijskimi faktorji z dodatkom pro-pluripotentnih miRNA učinkovitejše in hitrejše od običajne metode s transkripcijskimi faktorji in nadaljnji poskusi so pokazali, da je reprogramiranje somatskih celic mogoče tudi brez transkripcijskih faktorjev, kar se sklada s pozitivno povratno zanko med izražanjem osrednjih transkripcijskih faktorjev in pro-pluripotentnih miRNA.

Potencialni mehanizmi reprogramiranja z miRNA

Za reprogramiranje celic do iPSC in vzdrževanje pluripotentnosti je potrebnih več različnih procesov, kot so celična proliferacija, preureditev in modeliranje kromatina, MET (mezenhimatski do epitelijski prehod), inhibicija senescence in apoptoze ter regulacija alternativnega izrezovanja intronov. Pri teh procesih sodelujejo tarče nekaterih miRNA, ki so pokazale sposobnost promoviranja reprogramiranja. Potencialni mehanizmi reprogramiranja z miRNA so predlagani na osnovi funkcij miRNA v embrionalnih izvornih celicah.

Proliferacija

Pluripotentne izvorne celice imajo hiter celični cikel in nimajo G1-S kontrolne točke. V ESC je G1-S kontrolna točka regulirana z miR-302 in miR-291, -294 in -295. miR-302 utiša izražanje inhibitorjev ciklin E-Cdk2, kot sta p21 in RBL2 (retinoblastoma-like 2). Aktiven kompleks Ciklin E-Cdk2 je bistven za prehod G1-S v celičnem ciklu. Tako lahko miR-302 pospeši celični cikel in proliferacijo. Povečana proliferacija lahko olajša reprogramiranje z odstranitvijo epigenetskih markerjev, ki represirajo gene povezane s pluripotentnostjo v diferenciranih celicah.

Remodeliranje kromatina

Remodeliranje kromatina omogoči epigenetske spremembe (izbris metilacijskih vzorcev) in s tem spremeni izražanje genov. miR-302/367 in miR-369 sodelujejo pri epigenetski reaktivaciji genov za pluripotentnost, tako da regulirajo izražanje encimov, ki modificirajo kromatin, kot sta lizin-specifični histonski demetilazi AOF1 in AOF2. AOF1 demetilira histon H3 in je esencialna za de novo DNA metilacijo. Utišanje AOF2 vodi do zmanjšane prisotnosti Dnmt (DNA metiltrasnferaza) in do hipometilacije DNA po celotnem genomu. Utišanje AOF2 tako promovira izbris metilacije genoma in prepreči re-diferenciacijo delno reprogramiranih celic.

miR-302 utiša tudi izražanje metil-CpG-vezavnih proteinov GATA2B in MECP2, ki vežeta metilirano DNA in tvorita histonski deacetilazni kompleks, ki normalno represira transkripcijo. Utišanje izražanja GATA2B in MECP2 tako de-represira gene pomembne za reprogramiranje. Supresija GATA2B in MECP2 je povezana s pospešeno genomsko demetilacijo in specifično demetilacijo promotorja za transkripcijski faktor Nanog.

MET

Med reprogramiranje gredo fibroblasti preko MET, torej privzamejo vmesno epitelijsko stanje pluripotentnih celic, kar je en izmed zgodnjih pokazateljev reprogramiranja. Supresija obratnega prehoda (EMT) lahko poveča efektivnost reprogramiranja. miR-302 zmanjša ekspresijo TGF-β receptorja 2, ki sodeluje v TGF-β signalni poti, ki promovira EMT. BMP (kostni morfogenetski protein – ang. bone morphogenetic protein) signaliziranje promovira MET in njegovi inhibitorji so tarče miR-302. Reprogramirajoče miRNA torej promovirajo MET z inhibicijo TGF-β signalne poti in indukcijo BMP signaliziranja.

Senescenca in apoptoza

Primarne celice so nagnjene k senescenci in apoptozi med reprogramiranjem, zaradi aktivacije tumor supresorjev ob povečanem številu celičnih delitev. Reprogramirajoče miRNA sodelujejo pri inhibiciji senescence in apoptoze kot del mehanizma reprogramiranja. Kaspaza 2 in EI24 promovirata apoptozo in sta tarči miR-290/295, ki lahko obvaruje celice pred apoptozo, inducirano s stresom. miRNA s podobnim zaporedjem, med njimi tudi miR-302 imajo potencialni anti-apoptotski efekt, ki lahko poveča efektivnost reprogramiranja v primerjavi z reprogramiranjem s transkripcijskimi faktorji.

Alternativno izrezovanje

Pluripotentne izvorne celice izražajo več alternativnih povezovalnih variant mRNA. Alternativne izoforme določenih določenih genov lahko pripomorejo k celičnem prehodu med pluripotentno in diferencirano obliko. Alternativno izrezovanje lahko deluje kot stikalo med pluripotentnostjo in diferenciacijo (primer: FOXP1) in je lahko ključni mehanizem kontrole pluripotentnosti. Z uporabo bioinformatike so napovedali večje število genov, povezanih z alternativnim izrezovanjem, ki so potencialne tarče miR-302. tako lahko miR-302 omogoča celici preklopitev med izražanjem z diferenciacijo povezanimi alternativnimi izoformami in izražanjem s pluripotentnostjo povezanimi izoformami.

Ugotavljanje funkcije miRNA v ESC

Funkcijo specifičnih družin miRNA in vpliv inhibicije izražanja miRNA so znanstveniki ugotavljali s procesiranjem pluripotentnih celic, tako da so odstranili DGCR8 ali Dicer ter posledično uvedli specifično miRNA.

DGCR8-null ESCs

V DGCR8-null ESCs pride do zmanjšane proliferacije in nenormalnega celičnega cikla. Celice se zaustavijo v G1 fazi celičnega cikla, kar kaže na pomembno vlogo miRNA pri prehodu iz G1 v S fazo celičnega cikla.

Celice kažejo tudi delno utišanje pluripotentnih genov (Oct4, Nanog, …), kar povzroči zmanjšano izražanje diferenciacijskih markerjev ter onemogoča razvoj zarodnih plasti tkiv.

Dicer-null ESCs

Dicer-null ESCs imajo daljši G0 in G1 fazi, ter niso sposobne izraziti diferenciacijskih markerjev. Poleg tega pa se zmanjša tudi DNA metilacija ter izražanje metiltransferaz (Dnmts), poveča pa se telomerazna aktivnost. To privede do nepopolnega in reverzibilnga utišanja gena za Oct4 s tem pa se onemogoči proces diferenciacije ESCs v iPSC.

Ta opažanja sugestirajo, da ima Dicer vlogo pri procesiranju tudi drugih malih RNA molekul, ki uravnavajo delovanje celic.

Regulacija izražanja

Regulacija izražanja miRNA lahko poteka skupaj s procesiranjem miRNA. Pri tem lahko inhibiramo delovanje DGCR8 ali Dicer-ja, ki katalizirata reakciji zorenja miRNA ter s tem inhibiramo izražanje miRNA. Obstajajo tudi posredni mehanizmi za regulacijo izražanja s specifičnimi inhibitorji (anti-miRNA oligonukleotidi, miRNA maske ) ter dodatnim izražanjem miRNA s pomočjo miRNA posnemovalke.

• miRNA posnemovalke so kratke dvoverižne RNA molekule, ki imajo enako funkcijo kot zrele miRNA. Veriga, ki ne sodeluje v sestavi RISC kompleksa, je modificirana z vezavo na holesterol ali njemu podobne molekule, kar pripomore k vnosu v celice. Ker pa tak vnos ni specifičen in lahko s tem miRNA posnemovalke pridejo v vse celice, se te tehnike izogibajo.
• Anti-miRNA se vežejo na pri-miRNA, pre-miRNA ali zrelo miRNA preprečijo vezavo miRNA na mRNA.
• miRNA maske se komplementarno vežejo na specifičen mRNA, kamor bi se vezala miRNA ter s tem fizično onemogočijo dostop miRNA do tarčnih mRNA.

V primeru premišljenega in natančnega eksogenega izražanja miRNA inhibitorjev in miRNA posnemovalk lahko signifikantno spodbudimo produkcijo iPSC.

Prednosti in slabosti

Pri reprogramiranju ESCs z miRNA se je izkazalo, da je takšno reprogramiranje veliko bolj efektivno kot s pluripotentnimi faktorji (Oct4, Nanog, …), saj lahko vplivajo na več mRNA molekul hkrati. Poleg tega pa je odziv tudi hitrejši, ker vplivajo direktno na translacijo proteinov, ne na transkripcijo genov. Specifične miRNA (miR-290) lahko nadomestijo c-Myc ter s tem omogočijo večjo količino diferenciacije somatičnih celic v iPSC. Z miRNA reprogramiranjem ni vnosa eksogenega genetskega materiala, ki bi se lahko integriral v celični genom, s tem pa zmanjšana možnost, da bi prišlo do nezaželenih mutacij. S poznavanjem specifičnih funkcij družin miRNA pa lahko v celicah izzovemo specifične odzive.

Vsekakor pa ima induciranje pluripotentnosti z miRNA tudi slabosti, saj je zaenkrat raziskan le delček tega področja. Ker miRNA niso celično specifične bi morali razviti ustrezen usmerjen transport do tarčnih celic. Učinkovitost pri induciranju pluripotentnosti ovira tudi otežen prehod skozi celične membrane, sama neobstojnost RNA molekul in dejstvo da celici od zunaj vnesena RNA predstavlja tujek. Ta problem so reševali tako, da so večkrat v določenem časovnem razmiku dodali miRNA. Po vstavljanju miRNA v celice je prav tako težko napovedati in kontrolirati količino izražanja miRNA.