CRISPR/Cas9

Spreminjanje genomske DNA s pomočjo sistema CRISPR/Cas9

Uvod

Bakterije in arheje so za obrambo pred virusnimi okužbami razvile poseben od RNA odvisen sistem pridobljene imunosti, imenovan CRISPR/Cas (angl. clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated), ki specifično prepozna in reže tujo tarčno DNA. To se lahko s pridom izkoristi pri genomskem inženirstvu. To hitro razvijajoče področje raziskav sega vse od bazične znanosti do biotehnoloških aplikacij. Do sedaj znana orodja modificiranja genomske DNA so npr. nukleaze s cinkovimi prsti (ZFN) in nukleaze TAL efektorjev (TALEN). Delovanje teh specifičnih endonukleaz sproži željene spremembe v genomski DNA z izrabljanjem celičnih popravljalnih mehanizmov: združevanja nehomolognih koncev (NHEJ) in popravljanje s homologno rekombinacijo. V primerjavi s ZFN in TALEN se CRISPR/Cas9 sistem kaže kot bistveno enostavnejše in zanesljivejše orodje za spreminjanje genomske DNA, saj lahko protein Cas9 veže poljubno vodečo RNA (gRNA), katera je komplementarna tarčnemu zaporedju. Kompleks Cas9-gRNA prepozna vezavno mesto na genomski DNA, ki je definirano z najmanj 13 nt dolgim komplementarnim odsekom med gRNA in tarčno DNA navzgor od motiva PAM, kateri je nujno potreben za vezavo kompleksa in ima pri uporabljenemu sistemu iz Streptococcus pyogenes obliko NGG. Cepitev poteče 3 nt navzgor od tega zaporedja.

Povzetek rezultatov in metod

Mali in sod. so kot prvi uporabili sistem CRISPR/Cas9 za spreminjanje človeške genomske DNA v različnih celičnih linijah. Z različnimi eksperimentalnimi pristopi so pokazali, da je sistem CRISPR/Cas9 enako ali celo bolj učinkovit kot ZFN in TALEN pri induciranju popravljalnih mehanizmov DNA, na katerih temelji genomski inženiring.

Konstrukcija plazmidov

Za izražanje proteina Cas9 v jedru človeških celic so genu optimizirali kodone in dodali zapis za NLS iz virusa SV40 na 3' konec gena. Gen so s hierarhičnim združevanjem s PCR sestavili iz 9 kosov 500 bp dolge sintetične dsDNA (gBlocks) in ga prenesli v plazmid, ki je prilagojen izražanju v sesalskih celicah. Za izražanje gRNA so naročili sintetične 455 bp dolge fragmente DNA, ki so vsebovali celotno ekspresijsko kaseto – promotor, zapis za gRNA in poli (T) - ki so jih vnesli v vektor, ki se ga lahko uporablja v človeških celicah. Gen za Cas9 je bil tako pod kontrolo konstitutivnega promotorja iz virusa CMV, gRNA pa se je izražala s pomočjo človeškega promotorja U6 za RNA polimerazo III, ki je bil vključen v naročeni sintetični fragment.

Spremljanje homologne rekombinacije

Delovanje sistema so v celicah HEK293T preizkusili z domiselnim ekperimentom, kjer so v stabilni celični liniji s pomočjo homologne rekombinacije in ustrezno homologno donorsko DNA, popravili gen za GFP, ki je bil prekinjen s stop kodonom in 68 bp dolgim insertom iz genomskega lokusa AAVS1. Uspešnost homologne rekombinacije (»poprave« gena za GFP – celice so pričele izražati GFP) so lahko spremljali s pretočno citometrijo (ločevanje fluorescenčno označenih celic; FACS) in konfokalno mikroskopijo. Za tarčenje so preizkusili 2 različni gRNA, ki sta bili komplementarni vstavljenemu lokusu AAVS1 (T1 in T2). V eksperimentu so primerjali uspešnost homologne rekombinacije z nukleazama TALEN, ki sta vezali isto sekvenco. S pomočjo FACS so pokazali, da je bilo z uporabo sistema CRISPR/Cas9 z T1 gRNA GFP pozitivnih 3 %, z T2 pa kar 8 % celic. S TALEN so dosegli zgolj 0,5 % uspešnost rekombinacije.

Spremljanje NHEJ

Sistem so preizkusili tudi na nativnem lokusu AAVS1 (znan »varni pristan« za vstavljanje genov). Učinkovitost sistema CRISPR/Cas9, da preko NHEJ sproži insercije oz. delecije na tem lokusu, so spremljali s sekvenatorjem nove generacije (Illumina MiSeq Personal Sequencer). Z uporabo T1 oz. T2 gRNA so na celicah HEK293T dosegli insercije ali delecije v 10 % oz. 25 % branj s sekvenatorjem.

Zaključek

Študija Mali in sod. služi kot pomemben dokaz principa uporabe sistema CRISPR/Cas9 za uvajanje sprememb v genom sesalskih celic. Ostalim raziskovalcem so utrli pot za uporabo tega novega orodja za modificiranje genomov v človeškem sistemu. Opisali so uspešnost delovanja v različnih celičnih linijah in primerjali učinkovitost z uveljavljenimi metodami. Razvili so osnovne protokole, ki se jih lahko uporabi za aplikativne in bazične študije s pomočjo genomskega inženirstva. Številne objave uporabe tega sistema v zadnjem letu so dokaz pomembnosti tega pionirskega dela.

Članek

• Mali, P., et al. 2013. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339(6121):823