Transgenske kokoši
IZRAŽANJE HUMANE EKSTRACELULARNE SUPEROKSID DISMUTAZE V TRANSGENSKIH KOKOŠIH
[Byun SJ et al. Human extracellular superoxide dismutaze (EC-SOD) expression in transgenic chicken.]
Uvod
Superoksid dismutaza (SOD) je metaloprotein z antioksidativno encimsko funkcijo. Encimi iz družine SOD so deloma odgovorni za vzdrževanje nizkih vrednosti reaktivnih kisikovih zvrsti - to jim omogoča lastnost presnavljanja superoksidnega aniona v kisik in vodikov peroksid. Ena izmed 3 izoform encima je ekstracelularna SOD (EC-SOD). Le-ta je homotetrameren glikoprotein z vsebnostjo Cu in Zn in visoko afiniteto za heparin ter ostale sulfonirane glikozaminoglikane. Izražanje EC-SOD je visoko v pljučih, ledvicah, maternici in krvnih žilah. Nahaja se v ekstracelularnem matriksu in je edini antioksidant, ki cepi superoksid v ekstracelularnem kompartmentu. Pred oksidativnim stresom naj bi ščitila možgane, pljuča in ostala tkiva. Rekombinantno EC-SOD so doslej izrazili v CHO celicah, insektnih celicah, Pichii pastoris in E. coli, avtorji pa so jo prvič izrazili v ptičih.
Za dotično raziskavo so se odločili zaradi naraščajoče pomembnosti in zahtev po biofarmacevtskih proteinih, katerih proizvodnja pa je draga in časovno potratna. Avtorji so mnenja, da so za proizvodnjo farmacevtskih proteinov potrebne alternativne platforme in da je ena izmed možnosti uporaba transgenske živine kot bioreaktorjev. Transgenske kokoši imajo pred transgenskimi sesalci številne prednosti - sesalci potrebujejo relativno veliko površino za vzrejo, poleg tega pa je potrebnih nekaj let, da dosežejo spolno zrelost. V nasprotju s tem kokoši hitro dosežejo spolno zrelost, za vzrejo potrebujemo malo prostora, proizvedejo veliko jajc, ter ni prisotnih prionskih bolezni. Poleg tega imajo N-glikozilirani ogljikovi hidrati na koncu N-acetilnevramično kislino, kot je to pri ljudeh.
Povzetek metod in materialov
Najučinkovitejša metoda za ustvarjanje transgenskih ptičev je z uporabo lentivirusnih vektorjev, ki jih vnesemo v embrije sveže izleglih jajc. Avtorji so uporabili lentivirusni vektor, sestavljen iz: 5' dolge terminalne ponovitve, CMV promotorja, promotorja kokošjega ovalbumina, za katerim so vstavili gen za humano EC-SOD, promotorja SV40, gena za rezistenco na blasticidin in 3' dolge terminalne ponovitve. Lentivirusni vektor so psevdotipizirali z glikoproteinom virusa vezikularnega stomatitisa. V centralni del subgerminalne votline so v sveže izglegla jajca injicirali približno 5000 virusnih delcev na jajce.
Povzetek rezultatov
1 Ustvarjanje transgenskih kokoši, ki izražajo hEC-SOD
S 5000 virusnimi delci na jajce so injicirali 158 jajc, izvalilo se je 16 G0 piščancev. Ko so dosegli spolno zrelost, so z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) analizirali semensko tekočino 7 preživelih petelinov. Eden (A354) je bil nosilec tujega gena. Transgenskega petelina so križali s kokošjo divjega tipa, izvalilo se je 1195 piščancev. Med njimi sta bila dva transgenska (G1; G435, H148). Insercijo hEC-SOD so potrdili s Southern blot analizo. Oba ptiča sta bila moškega spola. Križali so ju s kokošmi divjega tipa, izvalilo se je 122 piščancev G2. Z analizo PCR so ugotovili, da je razmerje transgenskih proti ne-transgenskim piščancem 56/122 (G435, 30/60; H148, 26/62) in da ni signifikantnega odstopanja od razmerja, pričakovanega glede na dedovanje po Mendlovih zakonih. Naključno so izbrali 6 G2 piščancev in jih skupaj z obema G1 petelinoma analizirali, da bi ugotovili število kopij tujega gena. Vsi so imeli eno kopijo transgena in isto mesto insercije, iz česar so sklepali, da so vsi potomci istega prekurzorja zarodne celice. Za ugotavljanje mesta insercije hEC-SOD so analizirali genomsko DNA petelina G435.
2 Tkivno specifično izražanje hEC-SOD v jajcevodih transgenskih kokoši
Da bi se rekombinantni protein izrazil tkivno specifično, v jajcevodih kokoši, so v lentivirusni vektor vstavili 5' regulatorno sekvenco kokošjega ovalbumina. Analiza RT-PCR je pokazala, da se je mRNA hEC-SOD uspešno izrazila v jajcevodih transgenskih kokoši. Transkripti mRNA so bili večinoma omejeni na jajcevode, so pa detektirali tudi ektopično izražanje transgena, in sicer v trebušni slinavki, črevesju in možganskem tkivu.
3 Rekombinantni protein hEC-SOD iz beljaka je funkcionalen
Zbrali so jajca kokoši divjega tipa kot tudi jajca treh hemizigotnih kokoši G2. Rekombinanten hEC-SOD protein se je izražal v jajčnih beljakih transgenskih kokoši. Približna velikost protein je bila 30 kDa, koncentracija pa med 10 in 59 ng/mL. Da bi ugotovili, če je protein funkcionalen, so naredili test, s katerim so merili antioksidativno aktivnost proteina - rezultati so kazali na višjo antioksidativno aktivnost kot pri divjem tipu.
Zaključki
Avtorji so razvili nov sistem za produkcijo rekombinantne hEC-SOD z uporabo transgenskih kokoši oz. izražanja tega protein v beljakih transgenskih kokoši. Takšni sistemi so dobra perspektiva za komercialno produkcijo rekombinantnih proteinov.
