Arheologija, Whole-Genome Capture Method

UVOD Poznavanje genoma arheološko zanimivih primerkov je pomembno predvsem pri analizah v populacijski genetiki, na podlagi katerih se raziskuje preseljevanje narodov, ugotavlja zgodovinske povezave med posameznimi območji, ipd. Za natančno določitev genoma je potreben dovolj čist vzorec DNA. Glavni problem, s katerim se srečujejo znanstveniki, je propadanje DNA s časom. Tako se je izkazalo, da je v vzorcih teh starodavnih osebkov običajno manj kot 1% endogene DNA, vse ostalo pa predstavlja DNA iz okolja. Poleg tega je DNA razgrajena v majhne fragmente, kar dodatno oteži določevanje nukleotidnega zaporedja.

METODE

V predstavljeni študiji so razvili metodo zajema celotnega genoma v raztopini (anj: whole-genome in-solution capture) ali na kratko WISC, s katero nespecifično povečajo vsebnost endogene DNA v aDNA knjižnici, in njeno učinkovitost preverili na dvanajstih vzorcih, pridobljenih iz kosti, zob ali las ljudi, ki so živeli v železni oziroma bakreni dobi na območju Bolgarije, Peruja in Danske. DNA so iz vzorcev tkiva ekstrahirali po metodi, ki temelji na vezavi DNA na kolone s silicijevim dioksidom. Očiščeni DNA so popravili konce in dodali dA-rep, nato pa na njih vezali specifične Illumina adapterje. Nato so izvedli sekvenciranje knjižnic pred zajetjem endogene DNA. Za vabo, s katero so iz vzorca aDNA pridobili endogeno DNA, so pripravili biotinilirano RNA knjižnico človeškega genoma, s fragmenti dolgimi 200 – 300 bp. Na konce so jim pripeli T7 adapterje. V hibridizacijsko mešanico so dodali tudi oligonukleotide, ki so se vezali na adapterje ter preprečili nespecifične vezave preko adapterjev. Po hibridizaciji so z magnetnimi delci, na katerih je bil vezan streptavidin, iz raztopine ločili nevezane RNA-vabe in eksogeno DNA ter RNA vabe, ki so se hibridizirale na aDNA. Nato pa izvedli drugo sekvenciranje, tokrat knjižnic po zajetju endogene DNA.

REZULTATI

Analiza rezultatov sekvenciranja je pokazala, da se po uporabi metode WISC število odčitkov, ki so pripadali človeškemu genomu, poveča za 6-159-krat. V obeh knjižnicah je bila sestava eksogene DNA podobna, le da jo je bilo v knjižnicah po zajetju endogene DNA v vzorcu količinsko prisotne manj. V petih od dvanajstih knjižnic, pridobljenih po zajetju endogene DNA, so že z relativno kratkim sekvenciranjem dosegli zadostno pokrivanje mtDNA za okvirno določitev skupine haplotipa. Za vsako knjižnico posebej so določili število unikatnih SNP-jev, ki so jih uporabili za PCA analizo. PCA analiza je statistična metoda, s katero lahko najdemo linearne kombinacije markerjev, ki so značilni za različne genetske skupine. V knjižnicah, narejenih po zajetju endogene DNA, se je povečalo število unikatnih SNP-jev, kar je bistveno izboljšalo tudi statistično zanesljivost PCA analize. Rezultati so bili pričakovani – evropski vzorci so se uvrstili v območje značilno za evropejce, perujski vzorci pa so bili indijanskega porekla. Ugotovili so, da število unikatnih fragmentov v knjižnicah pred zajetjem endogene DNA linearno narašča s povečevanjem števila odčitkov, medtem ko v knjižnicah po zajetju število doseže plato že pri 4.000.000 očitkov, nato pa ne narašča več. Podoben trend se je pojavil tudi pri šestih kasneje testiranih knjižnicah.Za aDNA je značilna velika fragmentacija in povečana vsebnost G-C parov v primerjavi s A-T pari na konceh fragmentov. Pri primerjavi knjižnic pred in po zajetju endogene DNA se je izkazalo, da so vzorcu poškodb pri obeh skupinah podobni in značilni za aDNA.

ZAKLJUČEK

V predstavljeni raziskavi so razvili prvo metodo zajema celotnega genoma v raztopini ali na kratko WISC, s katero so nespecifično povečali vsebnost endogene DNA v aDNA knjižnici. Glavni problem te metode pa je premajhna specifičnost, zaradi katere knjižnice aDNA vsebujejo premalo endogene DNA za pokritje celotnega genoma. Uspešnost zajema genomskih fragmetov bi lahko izboljšali z optimizacijo ekstrakcije aDNA iz vzorcev tkiva in postopka priprave aDNA knjižnic. Kljub nekaterim pomankljivostim je metoda perspektiven pristop k enostavnejšem sekvenciranju aDNA

ČLANEK

Carpenter et al., Pulling out the 1%: Whole-Genome Capture for the Targeted Enrichment of Ancient DNA Sequencing Libraries, The American Journal of Human Genetics (2013), http://dx.doi.org/10.1016/j.ajhg.2013.10.002